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磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實操過程中有哪些注意事項,？“研究完某一蛋白的磷酸化情況后比較好也要研究一下該蛋白總的表達量 ”,。這有兩種方法,，一是：相同的 sample 在不同的 well 中上樣兩次，可在相同的gel上,，也可在不同的gel,。其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白）,，甚至還可跑另一個 gel ,，壓內(nèi)標。但是本人不建議如此做,，因為這樣比較時誤差還是較大的,。因此，比較公認的,，本人也建議如此的方法,，即：將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗用 strip solution 洗去。成都瑞普信生物技術有限公司專業(yè)的第三方PCR檢測公司,。

    ③待分離膠完全聚合后,，傾去其頂部的去離子水，用濾紙將水吸干,。④配制4％濃縮膠5mL,，加TEMED5μL、10％APS50μL,，混勻立即灌膠,，灌至頂部，并垂直插入Teflon齒梳,，室溫靜置20min待膠聚合,。⑤待膠完全聚合后拔出梳子，將凝膠置于電泳槽中,，加入電泳緩沖液,，用電泳緩沖液沖洗上時間就是金錢，效率就是生命唯有惜時才能成功,，唯有努力方可成就樣孔以去除氣泡,。2電泳①取各個處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度為6μg/μL,，和等體積2上樣緩沖液混合,，即為上樣液。②將上樣液于100℃沸水中煮沸5min,，使蛋白變性，冰上驟冷,，3000轉(zhuǎn)/min離心1min,。③每孔加上樣液15μL,，留一孔加10μL預染的Marker。加滿電泳緩沖液,，蓋上槽蓋,，接通電源，先用80v恒壓電泳,，約20min,，當指示劑溴酚藍進入分離膠后改用110v恒壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約處時關閉電源,，取出膠板,。3轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測①在電泳即將結(jié)束前，預先將PVDF膜浸泡在甲醇中15s,，然后用ddH2O漂洗2min,，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5min后開始后續(xù)操作。②在水中撬膠,，修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min,。③按黑面（負極）→海綿→濾紙→膠→PVDF膜→濾紙→海綿→紅面（正極）的順序制備轉(zhuǎn)膜“三明治”。成都瑞普信生物技術有限公司提供專業(yè)的第三方基礎實驗檢測,。貴州熒光定量第三方檢測公司推薦

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