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來源: 發(fā)布時(shí)間:2025-05-16

細(xì)菌的基因組大小約5×106bp,約含3000個(gè)基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA是相同的,,要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針,,通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫的辦法,,即將細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫,。然后用多種其它菌種的DNA作探針來篩選,,產(chǎn)生雜交信號的克隆被剔除,,***剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段,。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定,,亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針,,常常是比較繁瑣的。后期生產(chǎn)的儀器,,可作X射線背散射照相,、照相,。虹口區(qū)挑選探針按需定制

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為了制備cDNA 探針,首先需分離純化相應(yīng)mRNA,,這從含有大量mRNA的組織,、細(xì)胞中比較容易做到,如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA,。有了mRNA作模板后,,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA),,cDNA與待測基因的編碼區(qū)有完全相同的堿基順序,,但內(nèi)含子已在加工過程中切除。寡核苷酸探針是人工合成的,,與已知基因DNA互補(bǔ)的,,長度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。如*知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量,,也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列,,并用化學(xué)方法合成。嘉定區(qū)質(zhì)量探針品牌電子探針又稱微區(qū)X射線光譜分析儀,、X射線顯微分析儀,。

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(1)電子光學(xué)系統(tǒng)。電子束直徑0.1~1μm,,電子束穿透深度1~3μm,。被激發(fā)原子發(fā)射特征X射線譜過程如下:圍繞原子核運(yùn)動(dòng)的內(nèi)層電子,被電子束的電子轟擊后,,其他外層電子為補(bǔ)充轟擊出的電子而發(fā)生躍遷,,在躍遷過程中釋放出能量,即發(fā)射出X射線,。(2)X射線譜儀,。測量各種元素產(chǎn)生的X射線波長和強(qiáng)度,,并以此對微小體積中所含元素進(jìn)行定性和定量分析。特征X射線圖像顯像管的原理是:X射線束入射到一已知晶面間距的晶體上(X射線分光光度計(jì)的彎曲晶體上),,經(jīng)衍射后各種波長的X射線按不同的布拉格角彼此分開,,因此如轉(zhuǎn)動(dòng)晶體,,改變衍射角,,同時(shí)以兩倍于晶體的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)計(jì)數(shù)器,就可以依次測量出各種元素所產(chǎn)生的X射線波長和強(qiáng)度,,達(dá)到定性和定量分析的目的,。

為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交,有必要對探針加以標(biāo)記,,以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基,。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素-親合素系統(tǒng)、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法,。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時(shí)間較長,而且避免了同位素的污染,。**常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nick translation)。首先用適當(dāng)濃度的DNA酶Ⅰ(DNAseⅠ)在探針DNA雙鏈上造成缺口,,然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ(DNa poly merasⅠ)的5’→3’的外切酶活性,,切去帶有5’磷酸的核苷酸;同時(shí)又利用該酶的5’→3’聚酶活性,,使32P標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口,,DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用,使缺口不斷向3’的方向移動(dòng),,同時(shí)DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標(biāo)記的核苷酸所取代,。電子探針是運(yùn)用電子所形成的探測針(細(xì)電子束)作為X射線的激發(fā)源來進(jìn)行顯微X射線光譜分析的儀器。

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這樣我們可以事先建立一系列θ角與相應(yīng)元素的對應(yīng)關(guān)系,,當(dāng)某個(gè)由電子束激發(fā)的X特征射線照射到分光晶體上時(shí),,我們可在與入射方向交成2θ角的相應(yīng)方向上接收到該波長的X射線信號,同時(shí)也就測出了對應(yīng)的化學(xué)元素,。只要令探測器連續(xù)進(jìn)行2θ角的掃描,,即可在整個(gè)元素范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)連續(xù)測量。由分光晶體所分散的單一波長X射線被X射線檢測器接受,,常用的檢測器一般是正比計(jì)數(shù)器,。當(dāng)某一X射線光子進(jìn)入計(jì)數(shù)管后,管內(nèi)氣體電離,,并在電場作用下產(chǎn)生電脈沖信號,。電子探針是法國制成的,是在1949年用電子顯微鏡和X射線光譜儀組合而成,。虹口區(qū)挑選探針按需定制

波譜儀的關(guān)鍵在于怎樣實(shí)現(xiàn)將未知的特征譜線與已知元素Z聯(lián)系起來,?虹口區(qū)挑選探針按需定制

②隨機(jī)引物法,。隨機(jī)引物是指含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片斷的混合物,因此它可以與任意核苷酸序列雜交,,起到聚合酶反應(yīng)的引物作用,。將待標(biāo)記的DNA探針片斷變性后與隨機(jī)引物一起雜交,然后以此雜交的寡聚核苷酸為引物,,在大腸桿菌DNA聚合酶I大斷段(KlenowFragment)催化下,,合成與探針DNA互補(bǔ)的DNA鏈,當(dāng)在反應(yīng)體系中含有a-32P-dNTP時(shí),,即形成放射性同位素標(biāo)記的DNA探針,。具有上述優(yōu)點(diǎn),可代替缺口平移法,。此外大小,、單雙DNA均可標(biāo)記,標(biāo)記均勻,,標(biāo)記率高,,但也不能標(biāo)記環(huán)狀DNA。隨機(jī)引物法標(biāo)記探針一般長400~600bp,。虹口區(qū)挑選探針按需定制

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