CRISPR-Cas9基因編輯結果驗證：CRISPR-Cas9技術的發(fā)明,，是基因編輯技術的一大突破,，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法,，數(shù)字PCR技術可以滿足這一需求,。Broad研究所張鋒團隊發(fā)明了以CRISPR為基礎的SHERLOCK技術可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測,，但精確定量評估時仍采取了數(shù)字PCR進行確認。*****的伴隨診斷：常用體液來源（如血液,，胸腹水,，唾液及尿液等）的待檢標本中的DNA，有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源,，前者的量遠大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾,，實現(xiàn)**標記物的有效檢測,，如EGFR，ALK,，ROS1,，KRAS、BRAF等基因的突變檢測,、乳腺*/胃*的HER2基因擴增檢測等,，應用于**精細醫(yī)學的伴隨診斷?？梢杂脕眚炞C二代測序(NGS),。湖北熒光信號數(shù)字PCR歡迎咨詢

傳統(tǒng) PCR 或定量 PCR 反應都是在96/384孔板中進行的，因此早期的數(shù)字PCR技術也采用 96 /384孔板作為反應單元,。但是數(shù)字PCR技術的靈敏度取決于反應單元的總數(shù)n,，因此，理論上反應單元數(shù)越多越有利于提高靈敏度和準確度,，普通的96 /384孔板無法滿足檢測的需要,。而且，在96 /384 孔板中進行的PCR反應體系通常大于5μl,，由試劑消耗引起的高成本問題令人望而卻步,。針對上述問題， Morrison 等在25mm×75mm不銹鋼芯片上刻蝕了3072個直徑為300μm的微反應室(如圖2a所示),，每個反應單元的體積降低至33 nl,。該芯片可在商品化 PCR 儀上使用，與384 孔板的檢測靈敏度相當,，但反應體積降低為原來的1/64,，樣品通量提高了24倍。隨著反應單元數(shù)目的成倍增加,，反應體積從微升級降至納升級,，傳統(tǒng)的操作人員采用移液器加試樣的方式已經無法滿足快速精細取樣的要求，因此需要借助高通量自動點樣儀或機械手等設備,，這無疑大幅提高了系統(tǒng)的成本和操作的復雜性,。熒光信號數(shù)字PCR經驗豐富一般需要將樣品稀釋到單分子水平,，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應。

單細胞的基因表達分析：基因表達分析有助于了解細胞和組織的特征及其如何應對發(fā)育和環(huán)境信號的改變,。檢測已知和未知基因轉錄水平的方法在過去的四十多年來發(fā)生了翻天覆地的變化,，變得更加有效，更加敏感,，定量更加精細,，能夠一次性對大量的基因轉錄本進行分析。但是,，在組成復雜的細胞混合物中,，盡管***表達的基因可以被識別出來，但來自于少數(shù)細胞群體（例如干細胞）的轉錄本卻很可能會被掩蓋掉,，尤其是在每個細胞中以低豐度形式出現(xiàn)的轉錄本,。為了解決這個問題，單細胞檢測技術應用而生,，而且逐漸受到了越來越多的重視,。ddPCR在單細胞分析中的優(yōu)勢在于它不需要標準曲線就能進行***定量。而且,，由于能夠以非常高的敏感性區(qū)分至少五種不同的基因轉錄本,，因此無需進行其他方法所要求的單細胞cDNA預擴增，這可以消除預擴增和NGS文庫準備中潛在的轉錄本定量失真,，能夠能加真實的反映單細胞群體中關鍵基因的特征,。

微小殘留病變（minimalresidualdisease，MRD）：隨著化療,、靶向***,、造血干細胞移植等***方式的改進，血液**的***效果日益改善,。微小殘留?。∕RD）導致的復發(fā)是目前血液*****的一大難題。動態(tài)監(jiān)測MRD對于評價***療效,、預測疾病復發(fā),、實施個體化***具有重要的指導意義。MRD檢測方法需滿足可定量,、標準化,、便捷性的要求。目前**常見的是流式細胞學（flowcytometry,FCM）和PCR兩大類,但只有靈敏度高于10-4才能被納入標準化評估,。數(shù)字PCR技術,，其有限稀釋的特點可降低復雜的背景干擾，濃縮低豐度目的基因信號,，從而提高MRD檢測的靈敏度,。在慢性髓系白血病中,，Wang等同時用dPCR和qPCR檢測了61名CML患者的外周血，這些患者在每3個月一次連續(xù)3次的qPCR檢測中,，已經檢測不到BCR-ABL,，dPCR檢測到18%的患者是陽性的。在隨后的隨訪中,，dPCR能比qPCR提前幾個月檢測到BCR-ABL的升高,。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR檢測中，Drandi等在222例樣本中驗證了dPCR和qPCR方法的一致性,，還成功地將dPCR應用于3例qPCR無法檢測的病例,。數(shù)字PCR作為目前靈敏度和準確性比較高的分子檢測方法，非常適用于微小殘留病變評估,。目前有超過130萬條經鎖核酸修飾的引物，提供至少3種設計方案以滿足不同跨外顯子區(qū)域的檢測需求,。

可以使用幾種不同的方法來分配樣品,，包括微孔板，毛細管,，油乳劑和帶有核酸結合表面的小型化腔室陣列,。樣品的分配使人們可以通過假設分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理,，反應體系中目標分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算,，從而解決了多個目標分子存在于單個液滴中的可能性。同時,，從公式也可以看出,，隨著反應陽性體系數(shù)（X）的增加，體系中目標分子的拷貝數(shù)相對于X會有較大的差距,，隨著X的持續(xù)增加,，數(shù)字PCR結果的不確定度也隨著提高，總體來說,，數(shù)字PCR陽性體系的數(shù)量不得超過總體系數(shù)量的80%,。另一個方面，N的增加會使整個數(shù)字PCR體系具有較大的線性范圍,，并可以提高反應的靈敏度,、穩(wěn)定性以及可重復性。因此,，目前dPCR都需要在成本可控的情況下,，增加分配的腔室數(shù)和液滴數(shù)?？梢杂脕頇z測外泌體micRNA,。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR歡迎咨詢

近年來,，Bio-Rad、凱杰,、賽默飛等巨頭公司紛紛通過收購,、投資等方式布局數(shù)字PCR業(yè)務。湖北熒光信號數(shù)字PCR歡迎咨詢

微生物（病毒,、細菌等）的檢測：疾病預防控制中心,、出入境檢驗檢疫局系統(tǒng)的實驗室可以將基于TaqMan探針法的定量PCR體系無縫地轉移到數(shù)字PCR上，從而滿足該類實驗室對于檢測結果的要求：靈敏度更高,、重復性更好,、無需依賴標準曲線的***定量結果。其他應用：數(shù)字PCR還可以用于轉基因成分的檢測,、移植排斥監(jiān)控,、腸道菌群分析以及藥物基因組檢測等領域。隨著數(shù)字PCR熒光通道的增加和多指標檢測的成熟,，數(shù)字PCR將會進入更多應用領域,，有力推動生命科學、醫(yī)學診斷,、檢驗檢疫,、農業(yè)等領域的快速發(fā)展。湖北熒光信號數(shù)字PCR歡迎咨詢