焦磷酸測序(Pyrosequencing)隨著技術(shù)的不斷改進,，現(xiàn)在認(rèn)為焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是甲基化檢測新的金標(biāo)準(zhǔn)。焦磷酸測序作為一種新的序列分析技術(shù),，能夠快速地檢測甲基化的頻率,，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑,。在序列延伸過程中,，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T比例。因此,，不同位點的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測，并給出精確的甲基化程度的數(shù)據(jù),。QIAGEN公司在焦磷酸測序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢,，目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高,，適合不同的應(yīng)用,。PyroMarkQ24的強項在于可對多達24個樣品進行焦磷酸測序,。需要大樣品量的應(yīng)用更適合在PyroMarkQ96ID上進行。在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時,，運行通量**化可能會使實驗成本變得很高,。而PyroMarkQ96MD裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進行準(zhǔn)確測序,。這些不同平臺的推出,，對于我們實際研究提供了更有效的檢測手段。 中小樣本篩選, 大樣本中進一步驗證,。北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢

    WGBS送樣要求一,、送樣類型基因組DNA、細(xì)胞,、全血,、動植物組織、FFPE二,、保存方式1,、基因組DNA、細(xì)胞,、全血,、動植物組織：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi)),；保存期間避免反復(fù)凍融,。2、FFPE樣本：室溫保存三,、運輸條件1,、基因組DNA：冰袋或者干冰運輸；2,、細(xì)胞,、全血、組織樣本：干冰運輸,，順豐陸運（3-4天時間）,，夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰,；3,、FFPE樣本：室溫運輸。四,、樣本量要求1,、基因組DNA：常規(guī)WGBS，不少于2ug,；微量WGBS,，20ng1）提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果,，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；2）提取基因組DNA,，要加RNA酶,，去除RNA污染；3）提取基因組DNA,，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水,；樣本體積不超過100ul;4）提供Qubit檢測濃度，基于OD值的檢測方法,，例如NanoDrop,會嚴(yán)重高估濃度,。2、細(xì)胞樣本：常規(guī)WGBS,，不少于5x10*6個細(xì)胞,；微量WGBS，5000個細(xì)胞1）收集貼壁或者懸浮細(xì)胞,、使用預(yù)冷的1×PBS,，洗滌2次，600g離心5分鐘,；2）***一次離心后,，盡量去除上清PBS，保留細(xì)胞沉淀;3,、全血樣本：2-5ml外周血使用普通EDTA抗凝管,，避免使用肝素抗凝管。4,、動植物組織：動物組織,，30mg以上;植物組織，不同組織,。 北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢6mA在細(xì)菌,、藻類及動植物基因組中存在。

微生物定植對腸道免疫和代謝相關(guān)基因DNA甲基化的影響——團隊成員發(fā)表

Early microbial colonization

affects DNA methylation of genes related to intestinal immunity and metabolism

in preterm pigs. DNA Res. 2018 Jan 19. (IF= 5.415)

我們以早產(chǎn)幼豬為模型,，采用RRBS測序,，比較正常(CON,

n=7) 和口服*** (AB, n=7)早產(chǎn)豬的腸道DNA甲基化差異，發(fā)現(xiàn)***減少了細(xì)菌密度及多樣性,，同時改變了DNA甲基化水平,。其中與先天免疫應(yīng)答、吞噬,、內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)和組織代謝等相關(guān)基因的DNA甲基化和表達存在***的差異,。這種有賴腸道菌群的表觀遺傳修飾參與調(diào)控腸道免疫及營養(yǎng)代謝等，可能對早產(chǎn)兒的短期和長期的腸道健康至關(guān)重要。

技術(shù)優(yōu)勢

1,、ChIP-Seq 能實現(xiàn)真正的全基因組分析。目前所能獲得的芯片上固定的探針只能**全基因組部分序列,，所獲得的雜交信息具有偏向性,。

2、對于結(jié)合位點分析,，ChIP-Seq 通過尋找“峰”,，結(jié)合分辨率可精確到10~30 bp，而芯片上探針由于長度所限,，無法精確定位,，即使目前比較高水平的商業(yè)芯片都無法提供可與ChIP-Seq 媲美的分辨率。

3,、是所需樣本數(shù)量,。ChIP-chip 需要多達4~5 μg?的起始樣本，在雜交之前需要進行LM-PCR,，但可能導(dǎo)致背景增高,，競爭性擴增等導(dǎo)致假陽性。而ChIP-Seq *需要納克級起始材料,，如SOLiD 起始材料可低至20ng,。 WGBS用于人、哺乳動物及農(nóng)林牧漁方向的高水平甲基化研究,。

熒光定量法（Methylight）

這種技術(shù)是在MSP技術(shù)上發(fā)展起來的,，在MSP擴增過程中利用熒光染料進行定量。TaqMan? 探針法的應(yīng)用使得該技術(shù)具有更高的精確性,。其原理與SNP檢測類似,，針對亞硫酸氫鹽處理之后的DN**段，在甲基化位點上會存在單堿基的差異,，根據(jù)這種差異進行探針設(shè)計,，隨后進行實時定量PCR，就能夠檢測甲基化的差異,。這種方法**的優(yōu)勢在于其高敏感性和較高通量,，且無需在PCR后電泳、雜交等操作,，減少了污染和操作誤差,。但是TaqMan? 探針訂購費用較高，適用于少數(shù)位點大量樣本篩選,。 云生物提供測序服務(wù),。北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢

全基因組甲基化測序是將重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測序技術(shù)相結(jié)合。北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢

甲基化特異性PCR（MS-PCR）

DNA在亞硫酸氫鹽作用后，DNA CpG若無甲基化,，則序列中的C改變?yōu)閁,，若有甲基化則保持不變，因此從理論上講,，用不同的引物做PCR,，即可檢測出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化,。因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變,，就可以相應(yīng)設(shè)計M和U引物，有時我們需要設(shè)計兩輪引物,。

這種方法靈敏度高,，無需特殊儀器，因此經(jīng)濟實用,，是目前應(yīng)用**為***的檢測方法,。不過也存在一定的局限性，預(yù)先需要知道待測片段的DNA序列,，引物的設(shè)計非常重要,。另外，亞硫酸氫鹽處理也十分關(guān)鍵,，若處理不完全則可能導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn),。 北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢