《PNAS》解讀：去泛素化修飾

來源：發(fā)布時間：2025-02-21

鐵死亡是一種由大量脂質(zhì)過氧化物積累所驅(qū)動的調(diào)節(jié)性細胞死亡方式,，與腫LIU發(fā)BING密切相關(guān)，其調(diào)控機制尚不清楚,。因此,，深入理解腫LIU細胞抵抗鐵死亡的分子機制,，將為腫LIU治LIAO提供新策略。

2024年4月,，武漢大學醫(yī)學研究院,、教育部免YI與代謝前沿科學中心、中南醫(yī)院以及泰康生命醫(yī)學中心團隊在PNAS雜志上,，發(fā)表“USP8-governed GPX4 homeostasis orchestrates ferroptosis and cancer immunotherapy”的研究成果,。該研究揭示了USP8通過穩(wěn)定谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）來抵抗鐵死亡，并強調(diào)了靶向USP8作為一種潛在的治LIAO策略來促進鐵死亡,，以增強AI癥免YI治LIAO,。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）USP8的特異性敲除導致小鼠過早死亡，并伴有結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)紊亂和脂質(zhì)過氧化跡象,。

2）抑ZHIUSP8可以增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性,。改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治LIAO效果。

3）機制上,，USP8與GPX4相互作用,，并去除GPX4的多聚泛素化修飾，從而抑ZHI蛋白酶體介導的GPX4蛋白降解,，抑ZHI鐵死亡,，促進腫LIU進展。

表型相關(guān)性：

Usp8的特異性敲除導致小鼠壽命縮短,，腸上皮細胞死亡增加和脂質(zhì)過氧化跡象增多,。

功能研究：

體外抑ZHIUSP8增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。USP8抑ZHI劑聯(lián)合鐵死亡誘導劑能明顯抑ZHI腫LIU生長并改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治LIAO效果,。

機制研究：

前面的研究顯示USP8能抑ZHI鐵死亡,。為了進一步探索USP8介導鐵死亡調(diào)控的分子機制，檢測USP8是否可以調(diào)節(jié)鐵死亡通路中關(guān)鍵蛋白的表達,。

（1）初步確定下游的蛋白分子

通過WB檢測鐵死亡相關(guān)蛋白,，發(fā)現(xiàn)敲低明顯降低GPX4蛋白的表達（圖1a-b）,但不影響其RNA水平（圖1c）。同樣抑ZHI劑亦能降低GPX4的蛋白水平（圖1d）,。構(gòu)建GPX4 WT及其酶促失活突變體U46S進行功能實驗,，證實過表達GPX4 WT蛋白在抑ZHIRSL3誘導的鐵死亡方面具有功能（圖1e）。放線菌酮(CHX)試驗表明,，敲低USP8縮短GPX4蛋白的半衰期（圖1f）,。表明USP8可能作為一種去泛素化酶在翻譯后水平調(diào)節(jié)GPX4的蛋白豐度。

蛋白酶體介導的降解系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)是調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的兩大系統(tǒng),。而實驗表明蛋白酶體抑ZHI劑MG132挽救了敲減USP8介導的GPX4不穩(wěn)定,，而溶酶體抑ZHI劑巴弗洛霉素A1 (BafA1)和氯喹(CQ)則無此作用（圖1g），表明USP8介導的GPX4穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)取決于蛋白酶體系統(tǒng)。

圖1 USP8影響GPX4蛋白的穩(wěn)定性（Ref. Fig 4）

（2）分子互作機制

第一步,，確定與下游蛋白分子的互作關(guān)系

為了探索USP8與GPX4是否互作,，進行內(nèi)源Co-IP實驗和GST pulldown實驗，發(fā)現(xiàn)USP8與GPX4互作（圖2a-c）,。

第二步,，USP8與GPX4蛋白結(jié)合的具體的位置

為了探索USP8與GPX4蛋白結(jié)合的位置，針對USP8構(gòu)建不同的突變體分別進行Co-IP實驗,，發(fā)現(xiàn)USP8通過 aa1-313,、aa715-1118區(qū)域與GPX4結(jié)合（圖2d-e）。

第三步,，USP8如何影響GPX4蛋白的穩(wěn)定性

USP8是一個去泛素化酶,。Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，USP8能降低GPX4的泛素化水平,，而酶非活性突變體USP8-c786a則不能去除GPX4的泛素鏈,，表明USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（圖2f）。

圖2 USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（Ref. Fig 4/S4）

第四步,，確定USP8去除GPX4的Ub K48鏈泛素化

眾所周知,，泛素分子可以通過其七個賴氨酸(K)殘基中的一個(K6、K11,、K27,、K29、K33,、K48和K63)連接形成不同的泛素鏈,。基于此,，Co-IP分析發(fā)現(xiàn)GPX4被K27和K48連接的泛素化修飾（圖3a）。另外,，Co-IP分析顯示USP8過表達降低GPX4上K48連接的泛素化,，而不影響K27連接的泛素化（圖3b），表明USP8主要去除GPX4上K48連接的泛素化,。

體外去泛素化試驗表明（注：Ub(K48O)(只有完整的Lys48殘基的Ub)）,，USP8過表達以去泛素酶活性依賴性方式去除GPX4上K48連接的泛素化（圖3c）。

第五步,，確定USP8去除GPX4蛋白泛素化位點

之前的研究已報道K48,、K125、K127,、K135和K151是GPX4的潛在泛素化位點,。構(gòu)建不同的泛素化位點突變體進行Co-IP分析，發(fā)現(xiàn)GPX4 K48R、K125R,、K127R和K151R突變體K48連接的泛素化減少（圖3d）,。另外，USP8過表達降低GPX4 WT,、K125R,、K127R和K151R突變體的泛素化，但未能消去GPX4 K48R突變體的泛素化（圖3e）,。表明USP8主要去除GPX4上K48殘基的泛素化,。

綜上所述，這些結(jié)果表明USP8作為穩(wěn)定GPX4的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子,，主要通過去除GPX4上K48連接的泛素化來防止其蛋白酶體介導的降解,。

圖3 USP8去除GPX4上K48殘基的K48鏈泛素化（Ref. Fig4/S4）

結(jié)論：本研究在小鼠腸上皮細胞特異性敲除Usp8后，觀察到結(jié)腸結(jié)構(gòu)改變,，小鼠壽命縮短,，伴隨著腸上皮細胞死亡增加和脂質(zhì)過氧化跡象增多。功能上,，Usp8雜合缺失小鼠可抑ZHI結(jié)直腸腫LIU發(fā)生和發(fā)展,，體外抑ZHIUSP8可以增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。機制上,，USP8與GPX4發(fā)生相互作用,，并去除GPX4的多聚泛素化修飾，從而抑ZHI蛋白酶體介導的GPX4蛋白降解,。此外,，USP8抑ZHI劑聯(lián)合鐵死亡誘導劑能夠改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治LIAO效果。這項研究揭示了USP8通過調(diào)節(jié)GPX4的穩(wěn)態(tài)從而在體內(nèi)調(diào)控鐵死亡的機制,，為AI癥治LIAO提供了新的治LIAO靶點,。