聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,，其PCR擴(kuò)增是不會成功的,。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時其條帶更整齊,，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量,，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度,。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)放大簡單重復(fù)序列之間的區(qū)域,，以產(chǎn)生擴(kuò)增片段長度的獨特指紋,。連云港組織定量PCR方案

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA的斷裂,；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照,；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等,。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺期,，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度,、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān),。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),，均應(yīng)通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下,，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性,。寧波實時RT-PCR檢測技術(shù)方案如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：1976年,，中國科學(xué)家,，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn),。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，標(biāo)本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染,；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈,?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度,，復(fù)性溫度,，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。

聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是,，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物,，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息,。這意味著，通常情況下,，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標(biāo)區(qū)域上游的精確序列,，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體，并隨后在DNA合成過程中產(chǎn)生整個目標(biāo)區(qū)域,。像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變,。PCR的另一個限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴(kuò)增，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果,。為了很大限度地減少污染的可能性,，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨的房間,。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中,。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因,，突變由科學(xué)家隨意選擇,。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻,。引物特異性差,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。引物量過多,。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染,。確保操作的潔凈,。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭,，工作臺污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進(jìn)行清潔,。條帶大小與理論不符：污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進(jìn)行清潔,。模板或引物使用錯誤,。更換引物和模板,。基因亞型,。對研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。杭州組織PCR檢測技術(shù)原理及步驟

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列,，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。連云港組織定量PCR方案

聚合酶鏈?zhǔn)剑篜CR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2-4分鐘，2-3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍,。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。　PCR技術(shù)敏感性高,，特異性強,，操作簡便、快速,，在生命科學(xué)研究,、食品衛(wèi)生、醫(yī)療,、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面都具有重要的應(yīng)用價值,。連云港組織定量PCR方案