聚合酶鏈式反應：模板的制備,，PCR的模板可以是DNA,，也可以是RNA,。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標本如病毒、細菌,、菌類等,。也可以是病理生理標本如細胞、血液,、羊水細胞等,。法醫(yī)學標本有血斑、精斑,、毛發(fā)等,。標本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸,。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理,。難以破碎的細菌,，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA,，經(jīng)酚,、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板,。PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,。無錫分子生物學熒光PCR

聚合酶鏈式反應的試驗污染：陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功,、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志,。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好,，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）,。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,，檢驗人員心中有數(shù)時,，在以后的實驗中可免設陽性對照。陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照,。它包括：標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,，以監(jiān)測試劑是否污染,。無錫組織熒光PCR聚合酶鏈式反應：模板的制備，PCR的模板可以是DNA,，也可以是RNA。

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聚合酶鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂,；為了防止非特異性擴增,，必須設陰性對照；內(nèi)參的設定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進入平臺期,，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列,、二級結(jié)構(gòu)以及目標DNA起始的數(shù)量有關,。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù)，均應通過單獨實驗來確定,；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。重疊延伸聚合酶鏈反應可以將缺失、插入或點突變引入DNA序列,。

聚合酶鏈式反應準備：引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列,。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增,。引物3‘端的堿基,，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對,，很好選擇是G和C,。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,，引入突變位點,，用生物素、熒光物質(zhì),、地高辛標記,，加入其它短序列，包括起始密碼子,、終止密碼子等,。聚合酶鏈反應五要素：參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶,、dNTP,、模板和緩沖液。無錫組織熒光PCR

像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯,，這反過來會導致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。無錫分子生物學熒光PCR

PCR的反應條件：Tm=4（G+c）+（A+T）,，一般在45～55度,，溫度低容易退火但特異性低,；溫度高，不容易退火但特異性高,。退火時間30秒,。延伸溫度一般在70～75度這時TaqDNA聚合酶活性很高（150個/S），當引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法,，使在低溫下就開始合成,。一般<1KB時間1分鐘即可。當〈1KB時在較后的循環(huán)中延長擴增時間,。循環(huán)次數(shù)25～30次,。無產(chǎn)物時：取10ul擴增混合液作模板在進行PCR擴增；增加TaqDNA聚合酶濃度,；增加循環(huán)次數(shù),；降低退火溫度；加靶DNA量,。無錫分子生物學熒光PCR