聚合酶鏈式反應(yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L,；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L,；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）,；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù),；變性溫度和時間 95℃,，30s；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,，一般在45～55℃,；延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）,；Tm值=4(G+C) +2(A+T),；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量,。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量,。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后,，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”,。聚合酶鏈式反應(yīng)準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu,，分別來自兩種不同的噬熱菌。廣州骨頭數(shù)字PCR方案

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不完全互補,、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）。珠海分子生物學(xué)定量PCR網(wǎng)站PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當(dāng)日電泳檢測,，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染,，導(dǎo)致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或濺出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進頭等均應(yīng)一次性使用,。必要時,，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性,。可互相拼接,，與引物互補后,，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。

序列標簽站點是一個過程，其中PCR被用作基因組的特定片段存在于特定克隆中的指示物,。人類基因組計劃發(fā)現(xiàn)這一應(yīng)用對于繪制他們測序的粘?？寺∫约皡f(xié)調(diào)不同實驗室的結(jié)果至關(guān)重要。聚合酶鏈反應(yīng)的一個令人興奮的應(yīng)用是對來自遠古來源的DNA進行系統(tǒng)進化分析,，例如在尼安德特人的復(fù)原骨骼中,、從猛犸的冷凍組織中或從埃及木乃伊的大腦中發(fā)現(xiàn)的DNA已經(jīng)被放大和測序。]在某些情況下,，這些來源的高度降解的DNA可能在擴增的早期階段重新組裝,。聚合酶鏈反應(yīng)的一個常見應(yīng)用是對以下基因表達模式的研究。組織(甚至單個細胞)可以在不同階段進行分析,，以了解哪些基因變得活躍,，哪些基因被關(guān)閉。該應(yīng)用還可以使用定量聚合酶鏈反應(yīng)來定量表達的實際水平,。聚合酶鏈式反應(yīng)準備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列,。

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志,。陽性對照要選擇擴增度中等,、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,，如以重組質(zhì)粒為陽性對照,，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大,。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時,，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照,。陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括：標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,；被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照,。試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染,。序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)是一種用于DNA指紋識別的聚合酶鏈反應(yīng)方法。溫州分子生物學(xué)PCR檢測技術(shù)供應(yīng)商

電子聚合酶鏈反應(yīng)用于計算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果,。廣州骨頭數(shù)字PCR方案

聚合酶鏈式反應(yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，加入設(shè)計引物,，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。廣州骨頭數(shù)字PCR方案