聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補,、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）,。聚合酶鏈式反應(yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。南通分子生物學(xué)熒光定量PCR原理

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功,、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志,。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好,，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）,。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大,。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照,。陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括：標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,；被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照,。試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染,。南通分子生物學(xué)熒光定量PCR原理聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù),。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活,，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果,。模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果,。變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活,；過低則模板變性不徹底,。反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前,，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min,。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確,。是否純化，或因儲存條件不當而失活,。引物錯誤,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。 DNA凝膠電泳時加入陽性對照,，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段,，即使已知的引物序列不超過兩個,。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交,。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA,，有時是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進行分析,。脫氧核糖核酸測序的任務(wù)也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)來輔助完成,。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對擴增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段,，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈,。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體,，這可能只有少量可用,。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應(yīng)方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點的)插入片段,。聚合酶鏈式反應(yīng)的引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的,。

序列標簽站點是一個過程，其中PCR被用作基因組的特定片段存在于特定克隆中的指示物,。人類基因組計劃發(fā)現(xiàn)這一應(yīng)用對于繪制他們測序的粘?？寺∫约皡f(xié)調(diào)不同實驗室的結(jié)果至關(guān)重要。聚合酶鏈反應(yīng)的一個令人興奮的應(yīng)用是對來自遠古來源的DNA進行系統(tǒng)進化分析,，例如在尼安德特人的復(fù)原骨骼中,、從猛犸的冷凍組織中或從埃及木乃伊的大腦中發(fā)現(xiàn)的DNA已經(jīng)被放大和測序。]在某些情況下,，這些來源的高度降解的DNA可能在擴增的早期階段重新組裝,。聚合酶鏈反應(yīng)的一個常見應(yīng)用是對以下基因表達模式的研究。組織(甚至單個細胞)可以在不同階段進行分析,，以了解哪些基因變得活躍，哪些基因被關(guān)閉,。該應(yīng)用還可以使用定量聚合酶鏈反應(yīng)來定量表達的實際水平,。聚合酶鏈反應(yīng)可以用于分析病癥、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化。南通分子生物學(xué)熒光定量PCR原理

聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。南通分子生物學(xué)熒光定量PCR原理

聚合酶鏈式反應(yīng)：1976年,，中國科學(xué)家,，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶,，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻,。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，標本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣污染導(dǎo)致標本間污染,；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈,。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設(shè)備,，能在變性溫度,，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制,。南通分子生物學(xué)熒光定量PCR原理