聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈,。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,，活性很好）的作用下，以dNTP為原料,，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性,、退火和延伸,，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成,，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,。上海組織Real-time PCR研究方案

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。完整RNA 的提取和純化,，是進(jìn)行RNA 方面的研究工作,，如Nothern雜交、mRNA 分離,、RT-PCR,、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提,。所有ＲＮＡ的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),，即樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使白復(fù)合體變性,；對(duì)內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制,；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去,。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑，提取總核酸,，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來(lái),；直接在酸性條件下抽提,，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA 留在水相,。種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失，目前該方法的使用頻率已很低,。上海組織Real-time PCR研究方案許多疾病的未知病因的測(cè)序正在通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)得到解決,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA,，也可以是RNA,。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌,、菌類等,。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液,、羊水細(xì)胞等,。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑,、毛發(fā)等,。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸,。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理,。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理,。所得到的粗制DNA,，經(jīng)酚、氯仿抽提純化,，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,，PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。因此,，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液,，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì),。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國(guó)首先提出設(shè)想,，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法,，意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克水平。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合,；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃,、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍,。聚合酶鏈反應(yīng)具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn),。上海組織Real-time PCR研究方案

流聚合酶鏈反應(yīng)：一種偽等溫PCR方法,。上海組織Real-time PCR研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝,。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時(shí)由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈。因此,，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個(gè)循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床。上海組織Real-time PCR研究方案