逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應的原理是：提取組織或細胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板,，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。再以cDNA為模板進行PCR擴增,，而獲得目的基因或檢測基因表達,。完整RNA 的提取和純化,，是進行RNA 方面的研究工作,，如Nothern雜交、mRNA 分離,、RT-PCR,、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提,。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點,，即樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使白復合體變性,；對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制,；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去,。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑，提取總核酸,，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來,；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA 留在水相,。種提取方法將導致小分子量RNA 的丟失,，目前該方法的使用頻率已很低。電子聚合酶鏈反應是指計算工具使用給定的一組引物來擴增來自測序的基因組或轉(zhuǎn)錄組的DNA 序列,。深圳組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應體系中未加入酶,。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果,。模板含有雜質(zhì),。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果,。變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹底。反應系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10 min,。引物變質(zhì)失效,。人工合成的引物是否正確。是否純化,，或因儲存條件不當而失活,。引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物,。 DNA凝膠電泳時加入陽性對照,，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。上海實時Real-time PCR原理聚合酶鏈式反應PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程,。

聚合酶鏈式反應：模板的制備,，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA,。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標本如病毒、細菌,、菌類等,。也可以是病理生理標本如細胞、血液,、羊水細胞等,。法醫(yī)學標本有血斑、精斑,、毛發(fā)等,。標本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸,。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理,。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理,。所得到的粗制DNA,，經(jīng)酚、氯仿抽提純化,，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板,。

聚合酶鏈式反應是一種體外迅速擴增DN段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝,。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當溫度降低后又可以復形成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性,，并設(shè)計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應用,，并逐步應用于臨床。聚合酶鏈式反應準備：引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列,。

聚合酶鏈反應：流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法,。將溶液置于熱梯度下，而不是反復加熱和冷卻聚合酶鏈反應混合物,。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動對流流動自動將聚合酶鏈反應試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂,，從而反復啟動聚合酶鏈反應。通過利用混沌流場的出現(xiàn),，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù),，以產(chǎn)生特異和快速的PCR。這種對流聚合酶鏈反應設(shè)置明顯降低了設(shè)備功率需求和操作時間,。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應):用于從RNA中擴增DNA,。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜,，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列,，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點。如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置,。基因的5’端(對應于轉(zhuǎn)錄起始位點)通常通過 RACE-PCR (快速擴增cDNA末端)中,。聚合酶鏈反應非常敏感,，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝，用于測序,、克隆和分析。深圳組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈式反應中要確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻,。深圳組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈反應同時擴增單個精子中幾個基因座的能力]增強了極大地增強了通過研究減數(shù)分裂后染色體交叉來進行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù),。通過分析數(shù)千個單個精子，已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見的交叉事件,。類似地,，可以分析異常的缺失、插入,、易位或倒位,，所有這些都無需等待(或支付)漫長而艱苦的受精、胚胎發(fā)生等過程,。定點突變：聚合酶鏈反應可用于產(chǎn)生突變基因,，突變由科學家隨意選擇?？梢赃x擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。深圳組織PCR檢測技術(shù)