PCR的反應(yīng)條件：Tm=4（G+c）+（A+T）,，一般在45～55度,，溫度低容易退火但特異性低,；溫度高,，不容易退火但特異性高,。退火時(shí)間30秒,。延伸溫度一般在70～75度這時(shí)TaqDNA聚合酶活性很高（150個(gè)/S）,，當(dāng)引物在16個(gè)堿基以下時(shí)可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法,，使在低溫下就開始合成,。一般<1KB時(shí)間1分鐘即可,。當(dāng)〈1KB時(shí)在較后的循環(huán)中延長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)間。循環(huán)次數(shù)25～30次,。無(wú)產(chǎn)物時(shí)：取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增,；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數(shù),；降低退火溫度,；加靶DNA量,。電子聚合酶鏈反應(yīng)用于計(jì)算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。南通組織熒光PCR研究方案

聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)主要限制是,，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物,，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息。這意味著,，通常情況下,，PCR用戶必須知道兩個(gè)單鏈模板中每個(gè)模板上目標(biāo)區(qū)域上游的精確序列，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體,，并隨后在DNA合成過(guò)程中產(chǎn)生整個(gè)目標(biāo)區(qū)域,。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯(cuò),，這反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變,。PCR的另一個(gè)限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴(kuò)增,，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果,。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備,、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨(dú)的房間,。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器,。南通組織熒光PCR研究方案聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）,、引物（終濃度）,、模板DNA、Taq DNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）,、補(bǔ)加雙蒸水等。其中dNTP,、引物,、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整,，以上表格只提供大致參考值,。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）,、酶,、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設(shè)計(jì)方法,，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定,，但基本原則相同。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻,。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻,。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物,。引物量過(guò)多,。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過(guò)多,。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染,。確保操作的潔凈,。陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶：試劑，頭,，工作臺(tái)污染,。使用全新的試劑和頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔,。條帶大小與理論不符：污染,。使用全新的試劑和頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔,。模板或引物使用錯(cuò)誤,。更換引物和模板?；騺喰?。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,。

聚合酶鏈反應(yīng)有許多優(yōu)點(diǎn),。它很容易理解和使用，并迅速產(chǎn)生結(jié)果,。這項(xiàng)技術(shù)非常敏感,，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝,，用于測(cè)序,、克隆和分析。qRT-PCR具有與PCR相同的優(yōu)點(diǎn),，同時(shí)還具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn),。因此，它可以用于分析病癥,、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達(dá)水平的變化,。聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強(qiáng)大和實(shí)用的研究工具,。許多疾病的未知病因的測(cè)序正在通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。這項(xiàng)技術(shù)可以幫助我們識(shí)別與已知病毒相關(guān)的未知病毒序列,，從而讓我們更好地了解疾病本身,。如果該過(guò)程可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化，并且可以開發(fā)靈敏的非輻射檢測(cè)系統(tǒng),，PCR將在未來(lái)幾年在臨床實(shí)驗(yàn)室中占據(jù)明顯地位,。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))：用于從RNA中擴(kuò)增DNA。蘇州血液熒光定量PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,。南通組織熒光PCR研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul、50ul,?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí),，一定要模索條件,，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,，如變性溫度低,，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性,；退火溫度過(guò)低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。南通組織熒光PCR研究方案