聚合酶鏈式反應(yīng)準備：10×擴增緩沖液,、4種dNTP混合物（終濃度）,、引物（終濃度）、模板DNA,、Taq DNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）,、補加雙蒸水等。其中dNTP,、引物、模板DNA,、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整,，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段,，細胞內(nèi)DNA復制的引物為一段RNA鏈）,、酶、dNTP,、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設(shè)計方法，由PCR在實驗中的目的決定,，但基本原則相同,。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細的目標序列知識,。徐州血液數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失,。假陰性：不出現(xiàn)擴增條帶,。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性,，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用,， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究,。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì),，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚,。模板核酸變性不徹底,。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶,，極有可能是標本的消化處理,，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。徐州血液數(shù)字PCR應(yīng)用熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的,，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。

現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成,，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,，以減少一次升降溫過程,，提高了反應(yīng)速度。檢測：PCR反應(yīng)擴增出了高的拷貝數(shù),，下一步檢測就成了關(guān)鍵,。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測手段,。電泳法檢測特異性是不太高的,，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,，成為了主流檢測方法,。近年來以熒光探針為的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢,。

聚合酶鏈式反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)：預變性,，模板DNA完全變性與PCR酶的完全對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時間參考試劑說明書,，一般未修飾的Taq酶時間為兩分鐘,。變性步驟，循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性,，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性,，過短靶序列變性不徹底,，易造成擴增失敗。引物退火,，退火溫度需要從多方面去決定,，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調(diào)作為退火溫度,。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預估,。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。引物延伸,，引物延伸一般在72℃進行（Taq酶很適溫度）,。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定,，一般推薦在1000bp以上,，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp,。循環(huán)數(shù)，大多數(shù)PCR含25-35循環(huán),，過多易產(chǎn)生非特異擴增,。延伸，在一個循環(huán)后,，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全,，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。聚合酶鏈反應(yīng)的試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中,。

聚合酶鏈式反應(yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子,；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,，常用1.5mmol/L,；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L,；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）,；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù),；變性溫度和時間 95℃,，30s；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,，一般在45～55℃,；延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）,；Tm值=4(G+C) +2(A+T),；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量,。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個左右,，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程,。上海特殊樣本定量PCR方案

嵌套聚合酶鏈反應(yīng)：通過減少DNA非特異性擴增的背景,，提高DNA擴增的特異性。徐州血液數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈式反應(yīng)的步驟：標準的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA,；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈,。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下,，以dNTP為原料,，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈,。每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,。徐州血液數(shù)字PCR應(yīng)用