聚合酶鏈反應有許多優(yōu)點,。它很容易理解和使用,，并迅速產(chǎn)生結果。這項技術非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝，用于測序、克隆和分析。qRT-PCR具有與PCR相同的優(yōu)點，同時還具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點,。因此，它可以用于分析病癥、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化,。聚合酶鏈反應是一種非常強大和實用的研究工具,。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應得到解決。這項技術可以幫助我們識別與已知病毒相關的未知病毒序列,，從而讓我們更好地了解疾病本身,。如果該過程可以進一步簡化，并且可以開發(fā)靈敏的非輻射檢測系統(tǒng),，PCR將在未來幾年在臨床實驗室中占據(jù)明顯地位,。聚合酶鏈式反應準備：引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。廣州實時熒光定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大,，引物的特異性不高,。應調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多,。適當增加模板的量,，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好,，應降低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長,。應提高退火溫度,，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增,。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度,。 樣品處理不當。Mg2+濃度偏高,，因適當調(diào)整Mg2+使用濃度,。若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題,。復制提前終止,。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶,。廣州實時熒光定量PCR原理及步驟PCR的另一個限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導致誤導或模糊的結果,。

聚合酶鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照,；內(nèi)參的設定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等,。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進入平臺期,，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度,、序列、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關,。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù),，均應通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下,，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性,。

聚合酶鏈式反應是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術,。工具/原料：擴增緩沖液，四種dNTP,，引物,，模板DNA，Taq DNA聚合酶,， Mg離子,，蒸餾水。模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結合,，為下輪反應作準備,；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合,；引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈,。重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜,，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列,。

聚合酶鏈式反應：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個O,，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同,，即O原子造成U和T的不同，U分子化學式C4H4N2O2,，T胸腺嘧啶化學式C5H6N2O2,，現(xiàn)在將兩個分子式進行對比，U比T多了CH2,，結合前面的核糖區(qū)別,，還有一個O分子，其余結構相同,，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2,？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T？若從結構上說,，直接從U中加入一個CH2,，得到了T，這里面介入化學鍵的斷裂和重組,，但是這樣一來的話,，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子,，只是此時結構是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C）,，形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了。此時將這種分子導入受體細胞（亦或者蛋白質(zhì)）中,，表達的性質(zhì)一定不同于病毒表達的性質(zhì),。聚合酶鏈反應五要素：參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶,、dNTP,、模板和緩沖液。珠海組織定量PCR方案

聚合酶鏈式反應PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,。廣州實時熒光定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：反應緩沖液未完全融化或未充分混勻,。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物,。引物量過多。減少反應體系中引物的用量,。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng,，而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染,。確保操作的潔凈。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑,，頭,，工作臺污染。使用全新的試劑和頭,，對工作臺進行清潔,。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭,，對工作臺進行清潔,。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板,?；騺喰汀ρ芯康幕蜻M行序列分析和BLAST研究,。廣州實時熒光定量PCR原理及步驟