聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,，活性很好）的作用下,，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈,。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸,，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成,，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行,。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備,，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用,。蘇州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異),。它需要事先知道DNA序列，包括等位基因之間的差異,，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對(duì)緩沖液),。在模板和引物不匹配的情況下，嚴(yán)格條件下的PCR擴(kuò)增效率要低得多,，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴(kuò)增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性,。有關(guān)更多信息，請(qǐng)參見單核苷酸多態(tài)性基因分型,。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過對(duì)具有短重疊片段的長(zhǎng)寡核苷酸池進(jìn)行PCR來人工合成長(zhǎng)DNA序列,。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序,，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長(zhǎng)DNA產(chǎn)物,。珠海血液熒光PCR設(shè)計(jì)公司像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯(cuò),，這反過來會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變,。

聚合酶鏈反應(yīng)也可以用作以下敏感試驗(yàn)的一部分組織分型,，對(duì)移植至關(guān)重要。截至2008年,，甚至有人提議用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)取代傳統(tǒng)的血型抗體檢測(cè),。許多形式的病癥涉及致病基因的改變。通過使用基于聚合酶鏈反應(yīng)的測(cè)試來研究這些突變,，醫(yī)治方案有時(shí)可以根據(jù)患者的不同而不同,。聚合酶鏈反應(yīng)可以早期診斷惡性疾病，如白血病和淋巴瘤,，這是目前病癥研究中發(fā)展很快的,，并且已經(jīng)被常規(guī)使用。PCR檢測(cè)可以直接在基因組DNA樣品上進(jìn)行,，以檢測(cè)易位特異性惡性細(xì)胞,，其靈敏度至少是其他方法的10，000倍,。聚合酶鏈反應(yīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常有用,，因?yàn)樗试S分離和擴(kuò)增病癥抑制劑。例如,，定量PCR可以用于量化和分析單細(xì)胞,，以及識(shí)別DNA、mRNA和蛋白質(zhì)的確認(rèn)和組合,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖,，前者比后者多了一個(gè)O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同,，即O原子造成U和T的不同,，U分子化學(xué)式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2,，現(xiàn)在將兩個(gè)分子式進(jìn)行對(duì)比,，U比T多了CH2，結(jié)合前面的核糖區(qū)別,，還有一個(gè)O分子,，其余結(jié)構(gòu)相同，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2,？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T,？若從結(jié)構(gòu)上說，直接從U中加入一個(gè)CH2,，得到了T,，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話,，即使U變成了T,，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個(gè)O分子,，只是此時(shí)結(jié)構(gòu)是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C），形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了,。此時(shí)將這種分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（亦或者蛋白質(zhì)）中,，表達(dá)的性質(zhì)一定不同于病毒表達(dá)的性質(zhì)。在嵌套聚合酶鏈反應(yīng)中,，除了預(yù)期的靶之外,，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴(kuò)增的DN段組成。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,，但令人腦袋不適的問題是易污染,，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。 污染原因：標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,，或標(biāo)本放置時(shí),，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染,；標(biāo)本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,，導(dǎo)致彼此間的污染,。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣,、容器,、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染,。熱啟動(dòng)/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實(shí)現(xiàn)的,，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。珠海血液熒光PCR設(shè)計(jì)公司

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊,。蘇州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性,。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進(jìn)頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除。蘇州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)服務(wù)