PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會加快反應(yīng)速度,，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增,。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，低則合成產(chǎn)物量減少,。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,，一個30個循環(huán)的擴增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯誤率,。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s,。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長度在15～25時退火溫度,。聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是,，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴增的引物,，需要關(guān)于目標序列的先前信息,。武漢血液PCR檢測技術(shù)研究方案

現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成,，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程,，提高了反應(yīng)速度,。檢測：PCR反應(yīng)擴增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵,。熒光素（溴化乙錠,，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判,。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法,。近年來以熒光探針為的檢測方法,，有逐漸取代電泳法的趨勢。武漢血液PCR檢測技術(shù)研究方案PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當日電泳檢測,，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

聚合酶鏈式反應(yīng)準備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列,。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列,，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列,，否則易導(dǎo)致非特異性擴增,。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴格要求配對,，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾,。如附加限制酶位點,，引入突變位點，用生物素,、熒光物質(zhì),、地高辛標記，加入其它短序列,，包括起始密碼子,、終止密碼子等。

聚合酶鏈式反應(yīng)：定量PCR允許實時定量和檢測特定的DNA序列,，因為它在合成過程中測量濃度,。有兩種方法可以同時檢測和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料,。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標記的探針,。只有在探針與其互補DNA雜交后，才能使用這些方法檢測DNA,。一種有趣的技術(shù)組合是實時PCR和逆轉(zhuǎn)錄,。這種復(fù)雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR，允許定量少量RNA,。通過這種組合技術(shù),，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，并用qPCR進一步定量,。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應(yīng)終點出錯的可能性,，增加了檢測與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機會。實驗室使用RT-qPCR來靈敏地測量基因調(diào)控,。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)用于連接含有基因,、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段。

聚合酶鏈式反應(yīng)是一種體外迅速擴增DN段的技術(shù),，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床,。聚合酶鏈式反應(yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。武漢血液PCR檢測技術(shù)研究方案

重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以創(chuàng)造特定的長DNA構(gòu)建體,。武漢血液PCR檢測技術(shù)研究方案

聚合酶鏈式反應(yīng)準備：PCR引物設(shè)計：PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準）,，5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設(shè)計的基本原則：引物長度：15-30bp,，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳,，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照,。武漢血液PCR檢測技術(shù)研究方案