聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu,，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配,。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能,。所以實際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴增用的DNA,，可以是任何來源,，但有兩個原則，純度必須較高,，第二濃度不能太高以免抑制,。緩沖液的成分很為復雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系,，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系,；一價陽離子，一般采用鉀離子,，但在特殊情況下也可使用銨根離子,；二價陽離子，即鎂離子,，根據(jù)反應體系確定,，除特殊情況外不需調整；輔助成分,，常見的有DMSO,、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構,。聚合酶鏈反應非常敏感,，有可能產生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產品的拷貝，用于測序,、克隆和分析,。徐州微量定量PCR原理

聚合酶鏈式反應：反應的控制：PCR反應的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子；鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高,，常用1.5mmol/L,；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L,；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）,；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L,；反應溫度和循環(huán)次數(shù)；變性溫度和時間 95℃,，30s,；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃,；延伸溫度和時間 72℃,，1min/kb(10kb內）；Tm值=4(G+C) +2(A+T),；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次,。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量,。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右,，循環(huán)數(shù)超過30個以后,，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”,。莆田骨頭定量PCR現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成,。

聚合酶鏈式反應的特點：特異性強,，PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結合；堿基配對原則,；Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性,；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵,。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的,。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行,，結合的特異性增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度,。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),，其特異性程度就更高。

基于聚合酶鏈反應的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學中得到較廣應用：遺傳指紋以其辨別力的形式,，可以從世界上所有人群中獨特地區(qū)分任何一個人,。微小的DNA樣本可以從犯罪現(xiàn)場，和比較的從嫌疑人那里,，或者從DNA資料庫早期的證據(jù)或罪犯,。這些測試的簡單版本通常用于在刑事調查中快速排除嫌疑人,。幾十年前的犯罪證據(jù)可以被檢驗，確認或免責很初被定罪的人,。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定,，在親子鑒定中，一個人和他的近親相匹配,?？梢詼y試未知人類遺骸的DNA，并與可能的父母,、兄弟姐妹或兒童進行比較,。類似的測試可以用來確認被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母。新生兒的實際生父也可以被確認(或排除),。序列間特異性聚合酶鏈反應是一種用于DNA指紋識別的聚合酶鏈反應方法,。

聚合酶鏈反應：嵌套聚合酶鏈反應:通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性,。兩組引物用于兩個連續(xù)的PCR,。在個反應中，一對引物用于產生DNA產物,，除了預期的靶之外,，該產物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成。然后用一組引物將產物用于第二次聚合酶鏈反應,，所述引物的結合位點完全或部分不同于次反應中使用的每個引物,，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,，但它需要更詳細的目標序列知識,。重疊延伸聚合酶鏈反應或者通過重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個或多個含有互補序列的DN段拼接在一起的基因工程技術。它用于連接含有基因,、調節(jié)序列或突變的DN段,；這項技術可以創(chuàng)造特定的長DNA構建體。它還可以將缺失,、插入或點突變引入DNA序列,。聚合酶鏈反應應經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。莆田骨頭定量PCR

重疊延伸聚合酶鏈反應用于連接含有基因,、調節(jié)序列或突變的DN段,。徐州微量定量PCR原理

聚合酶鏈式反應的步驟：標準的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA,；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈,。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,，活性很好）的作用下，以dNTP為原料,，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸,，DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成,，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,。徐州微量定量PCR原理

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