聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=-6）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞,；在病毒的檢測(cè)中,，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個(gè)細(xì)菌,。簡(jiǎn)便,、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后,，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,，不一定要用同位素,，無(wú)放射性污染、易推廣,。純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液,、體腔液、洗嗽液,、毛發(fā),、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè),。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列,。黃山細(xì)胞數(shù)字PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,；堿基配對(duì)原則,；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性,。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵,。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性,，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行,，結(jié)合的特異性增加,，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),，其特異性程度就更高,。溫州微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商聚合酶鏈反應(yīng)具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)。

聚合酶鏈反應(yīng)：嵌套聚合酶鏈反應(yīng):通過(guò)減少DNA非特異性擴(kuò)增的背景,，提高DNA擴(kuò)增的特異性,。兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。在個(gè)反應(yīng)中,，一對(duì)引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物,，除了預(yù)期的靶之外，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴(kuò)增的DN段組成,。然后用一組引物將產(chǎn)物用于第二次聚合酶鏈反應(yīng),，所述引物的結(jié)合位點(diǎn)完全或部分不同于次反應(yīng)中使用的每個(gè)引物，并且位于其中的3’,。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)或者通過(guò)重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù),。它用于連接含有基因,、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段；這項(xiàng)技術(shù)可以創(chuàng)造特定的長(zhǎng)DNA構(gòu)建體,。它還可以將缺失,、插入或點(diǎn)突變引入DNA序列,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性,，模板DNA完全變性與PCR酶的完全對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū),，一般未修飾的Taq酶時(shí)間為兩分鐘,。變性步驟，循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性,，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性,，過(guò)短靶序列變性不徹底,，易造成擴(kuò)增失敗。引物退火,，退火溫度需要從多方面去決定,，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度,。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估,。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響,。引物延伸，引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶很適溫度）,。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí),，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上,，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp,。循環(huán)數(shù)，大多數(shù)PCR含25-35循環(huán),，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增,。延伸，在一個(gè)循環(huán)后,，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全,，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。熱啟動(dòng)/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過(guò)新的雜合聚合酶實(shí)現(xiàn)的,，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）,、引物（終濃度）,、模板DNA、Taq DNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）,、補(bǔ)加雙蒸水等。其中dNTP,、引物,、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整,，以上表格只提供大致參考值,。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）,、酶,、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設(shè)計(jì)方法,，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同,。如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來(lái)繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。黃山細(xì)胞數(shù)字PCR

熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以通過(guò)將反應(yīng)組分加熱到變性溫度在加入聚合酶之前。黃山細(xì)胞數(shù)字PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),，是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理,，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過(guò)這項(xiàng)技術(shù),，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因,，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡(jiǎn)單,，廉價(jià)和可靠的方法復(fù)制DN段,，這個(gè)概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。 PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù),。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究,，犯罪取證和分子考古學(xué)。通常,，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成,，稱為熱循環(huán)，每個(gè)循環(huán)通常由兩個(gè)或三個(gè)離散的溫度步驟組成,。黃山細(xì)胞數(shù)字PCR

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