聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備,，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象,，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌,、菌類(lèi)等,。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液,、羊水細(xì)胞等,。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑,、精斑、毛發(fā)等,。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì),，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理,。難以破碎的細(xì)菌,，可用溶菌酶加EDTA處理,。所得到的粗制DNA,，經(jīng)酚、氯仿抽提純化,，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板,。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯(cuò),，這反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變,。南京分子生物學(xué)定量PCR研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個(gè)O,，由于多出來(lái)的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同,，即O原子造成U和T的不同，U分子化學(xué)式C4H4N2O2,，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2,，現(xiàn)在將兩個(gè)分子式進(jìn)行對(duì)比，U比T多了CH2,，結(jié)合前面的核糖區(qū)別,，還有一個(gè)O分子，其余結(jié)構(gòu)相同,，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2,？或者說(shuō)如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T？若從結(jié)構(gòu)上說(shuō),，直接從U中加入一個(gè)CH2,，得到了T，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組,，但是這樣一來(lái)的話(huà),，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個(gè)O分子,，只是此時(shí)結(jié)構(gòu)是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C）,，形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了。此時(shí)將這種分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（亦或者蛋白質(zhì)）中，表達(dá)的性質(zhì)一定不同于病毒表達(dá)的性質(zhì),。寧波骨頭Real-time PCR原理及步驟流聚合酶鏈反應(yīng)：一種偽等溫PCR方法,。

聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)主要限制是，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物,，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息,。這意味著，通常情況下,，PCR用戶(hù)必須知道兩個(gè)單鏈模板中每個(gè)模板上目標(biāo)區(qū)域上游的精確序列,，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體，并隨后在DNA合成過(guò)程中產(chǎn)生整個(gè)目標(biāo)區(qū)域,。像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯(cuò),，這反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變,。PCR的另一個(gè)限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴(kuò)增,，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果,。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備,、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨(dú)的房間,。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力,。其污染可能性也很大,。污染的監(jiān)測(cè)：一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施，防止和消除污染,。重復(fù)性試驗(yàn),。選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,，但令人腦袋不適的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。 污染原因：標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,，或標(biāo)本放置時(shí),，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染,；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中,，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,，導(dǎo)致彼此間的污染,。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣,、容器,、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。熱啟動(dòng)/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過(guò)新的雜合聚合酶實(shí)現(xiàn)的,，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍,。深圳血液定量PCR原理

聚合酶鏈反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶,、dNTP,、模板和緩沖液。南京分子生物學(xué)定量PCR研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中很主要很常見(jiàn)的污染問(wèn)題,。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml）,，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,，就可形成假陽(yáng)性,。還有一種容易忽視，很可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染,。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí),、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染,。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝,，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題,。南京分子生物學(xué)定量PCR研究方案

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