膜片鉗操作實(shí)驗(yàn)：標(biāo)本制備根據(jù)研究目的的不同,，可采用不同的細(xì)胞組織,，如心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞,、細(xì)胞等,，現(xiàn)在幾乎可對(duì)各種細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗的研究。對(duì)所采用的細(xì)胞,，必須滿足實(shí)驗(yàn)要求,，一般多采用酶解分離法，也可采用細(xì)胞培養(yǎng)法,；另外,，由于與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，現(xiàn)在也運(yùn)用分子克隆技術(shù)表達(dá)不同的離子通道,，如利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)外源性基因等,。電極在實(shí)驗(yàn)前要灌注電極液，由于電極較細(xì),，因此在充灌前,，電極內(nèi)液要用0.2 μm的濾膜進(jìn)行過濾。一般電極充灌可分灌尖(tipfilling)和后充兩步灌尖時(shí)將電極浸入內(nèi)液中5s即可,。膜片鉗的應(yīng)用：對(duì)藥物作用機(jī)制的研究,。神經(jīng)生物學(xué)膜片鉗技術(shù)服務(wù)

腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)全細(xì)胞記錄：用可視化膜片鉗尋找清楚、且表面光滑、折光性較好的突觸后神經(jīng)元,。在加了正壓后,，將記錄電極移入腦片視野中，并接近事先選好的神經(jīng)元,，然后,，調(diào)整電極與神經(jīng)元的相對(duì)位置，利用負(fù)壓形成穩(wěn)定的高阻封接,。用短簇的脈沖負(fù)壓使細(xì)胞破膜,，穩(wěn)定2~3分鐘，觀察封接測(cè)試波形起始段與基線間的差值是否在100pA以內(nèi),，封接電阻是否大于200M,，如果是，且較穩(wěn)定,，再迅速補(bǔ)償串聯(lián)電阻和慢電容,，舍棄串聯(lián)電阻大于30M的細(xì)胞，且在記錄過程中監(jiān)測(cè)串聯(lián)電阻的變化,，當(dāng)變化大于20%時(shí),，中止記錄。如果細(xì)胞狀態(tài)不好,，就馬上重新制備腦片,，以提高實(shí)驗(yàn)效率。東莞神經(jīng)生物學(xué)膜片鉗實(shí)驗(yàn)?zāi)募液媚てQ使用的注意事項(xiàng)：向玻璃微電極灌注內(nèi)液時(shí)切勿灌太多,，以防液體進(jìn)入銀絲底部增加噪聲,。

膜片鉗技術(shù)的工作原理：膜片鉗技術(shù)是用于了解離了通道行為的通用型電生理工具，首先用微玻管電極(膜片電極或膜片吸管)接觸細(xì)胞膜,，然后以千兆歐姆以上的阻抗使電極尖銳端與細(xì)胞膜封接,，通過吸破或者電破的方式使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域與其周圍區(qū)域在電學(xué)上分隔，然后細(xì)胞膜破裂,，進(jìn)而對(duì)此區(qū)域上的離子通道的離子電流進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方法,。該方法普遍應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞，肌纖維細(xì)胞,，心肌細(xì)胞及高表達(dá)單一通道的卵母細(xì)胞,。主要用于監(jiān)測(cè)離子通道在正常或者疾病狀態(tài)下如何表現(xiàn),，以及不同藥物,、離子或其他分析物如何改變這些狀態(tài)。膜片鉗技術(shù)的建立,，對(duì)生物科學(xué)特別是神經(jīng)科學(xué)是一項(xiàng)具有重大意義的變革,。這是一種通過離子通道記錄的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的(或多個(gè))的離子通道活動(dòng)的技術(shù),。該技術(shù)的出現(xiàn)將生理學(xué)的細(xì)胞水平和分子水平聯(lián)系在一起，又將神經(jīng)科學(xué)的不同亞科融匯在一起,，促進(jìn)了各個(gè)學(xué)科之間的聯(lián)系,，加速了我們神經(jīng)科學(xué)的研究進(jìn)展，深入探討神經(jīng)活動(dòng)的機(jī)制研究,。

膜片鉗電生理技術(shù)的基本原理：膜片鉗技術(shù)用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面,，使之形成10~100MΩ的高阻封接，被孤立的小膜片面積為微米數(shù)量級(jí),，因此封接范圍內(nèi)細(xì)胞膜只有少數(shù)離子通道,。然后對(duì)該膜片實(shí)行電壓鉗位，測(cè)量單個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的微小電流,，這種通道的開放是一種隨機(jī)過程。通過觀測(cè)單個(gè)通道開放的電流幅值分布,、開放概率,、開放壽命分布等功能參數(shù)，并分析它們與膜電位,、離子濃度等之間的關(guān)系,。將該部分細(xì)胞采用負(fù)壓吸破，可以形成較常見的全細(xì)胞記錄模式,，可以研究整個(gè)細(xì)胞的生理功能和離子通道電生理功能,。更進(jìn)一步，還可以把吸管吸附放膜片從細(xì)胞膜上分離出來,，以膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,。這種技術(shù)對(duì)膜內(nèi)外溶液成分及施加藥物操作都很方便。全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)：藥物消耗極低,。每次更換的外液只需十幾微升,。

膜片鉗在通道研究中的重要作用：對(duì)離子通道生理與病理情況下作用機(jī)制的研究：通過對(duì)各種生理或病理情況下細(xì)胞膜某種離子通道特性的研究，了解該離子的生理意義及其在疾病過程中的作用機(jī)制,。如對(duì)鈣離子在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損害中作用機(jī)制的研究表明,，缺血性腦損害過程中，Ca2+ 介導(dǎo)現(xiàn)象起非常重要的作用,，缺血缺氧使Ca2+通道開放,，過多的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)Ca2+超載，導(dǎo)致神經(jīng)元及細(xì)胞膜損害,，膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙,，嚴(yán)重的可使神經(jīng)元壞死。膜片鉗使用操作注意：拉制儀提前預(yù)熱（至少30min）,。且用完及時(shí)關(guān)閉,。金華藥理學(xué)電生理膜片鉗方案

膜片鉗技術(shù)是用來研究單個(gè)離體的活細(xì)胞,、組織切片或細(xì)胞膜片離子流的電生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)。神經(jīng)生物學(xué)膜片鉗技術(shù)服務(wù)

膜片鉗又稱單通道電流記錄技術(shù),，用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面,，使之形成10～100的密封(giga-seal)，又稱巨阻封接,，被孤立的小膜片面積為μm量級(jí),，內(nèi)中只有少數(shù)離子通道。然后對(duì)該膜片實(shí)行電壓鉗位,，可測(cè)量單個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的pA（10的負(fù)12次方安培）量級(jí)的電流,，這種通道開放是一種隨機(jī)過程。通過觀測(cè)單個(gè)通道開放和關(guān)閉的電流變化,，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布,、開放幾率、開放壽命分布等功能參量,，并分析它們與膜電位,、離子濃度等之間的關(guān)系。還可把吸管吸附的膜片從細(xì)胞膜上分離出來,，以膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,。這種技術(shù)對(duì)小細(xì)胞的電壓鉗位、改變膜內(nèi)外溶液成分以及施加藥物都很方便,。神經(jīng)生物學(xué)膜片鉗技術(shù)服務(wù)

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