聚合酶鏈式反應生物學研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎發(fā)展出包括Real-time PCR在內(nèi)的多項應用技術。自誕生后Real-time PCR技術持續(xù)發(fā)展,，從簡單的增擴到整個PCR過程，Real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感,、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環(huán)增擴曲線的增長,。事實并非如此，早期的軟件不能在運行期間提供可視化的增擴曲線,。主要是因為SDS軟件采用整個平臺較終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作,，而不是分析每個單獨的反應循環(huán)。對某些設備來說,，必須向分析軟件提供實時的數(shù)據(jù),，有些設備則不需要。前一種設備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴曲線,，同時顯示在電腦屏幕上,。Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同,。南京細胞Real-time PCR研究方案

Real-time PCR鏈反應的常見問題分析與解決方法：反應緩沖液未完全融化或未充分混勻,。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻,。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物,。引物量過多,。減少反應體系中引物的用量。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng,，而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染,。確保操作的潔凈,。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭,，工作臺污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔,。條帶大小與理論不符：污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔,。模板或引物使用錯誤,。更換引物和模板?；騺喰?。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜,，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列,。湖州血液定量PCRReal-time PCR在實驗過程中注意避免mRNA的斷裂。

Real-time PCR鏈式反應：每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展,。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術變得非常簡捷,、同時也降低了成本，PCR技術得以大量應用,，并逐步應用于臨床,。多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制,。引物的設計注意事項：1,，注意引物設計好后的產(chǎn)物長度,。Real-time PCR的較佳產(chǎn)物長度在150-250kb左右（書上說這樣可以增加熒光的敏感度，減少實驗誤差,，但是我對這個說法持懷疑態(tài)度,。產(chǎn)物長度越大，SYBR嵌入的越多,，這樣才能夠保證之后的熒光值比較可信）,。2，不同的管家基因擴增效率不同,。所以在做整個實驗之前應該做一次檢測擴增效率的實驗,。如果擴增效率相差太大，就不能使用delt,，deltCt法來比較基因表達量的高低,。

Real-time PCR原理：基于探針的化學法，Real-time PCR應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物,；依賴熒光能量共振傳遞（FRET）檢測特異性擴增產(chǎn)物,，單單檢測特異性擴增產(chǎn)物，DNA及RNA定量,；基因表達驗證,；等位基因鑒別；SNP分型,；病原體和病毒檢測,；多重PCR，探針和目標片段的特異性結合產(chǎn)生熒光信號,，因此減少了背景熒光和假陽性,；探針可標記不同波長的熒光基團，用于多重PCR反應,。對于不同的靶序列需要合成不同的探針,，原料成本較高?；谔结樀幕瘜W法,，Real-time PCR應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物。

聚合酶鏈式反應準備：PCR引物設計,，PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物,。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準）,，5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補,。引物設計的基本原則：引物長度：15-30bp,，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照,。聚合酶鏈反應是是一種簡單,，廉價和可靠的方法復制DN段。常州細胞PCR檢測技術

Real-time PCR是在PCR擴增過程中,，通過熒光信號,，對PCR進程進行實時檢測。南京細胞Real-time PCR研究方案

Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同,，所以對引物的設計要求也不同,。普通PCR的實驗目的只是為了獲得目的基因產(chǎn)物，允許有非特異擴增,，只要目標條帶清晰明亮,，就可以通過切膠回收的方法回收目標條帶，之后進行后續(xù)的克隆,、測序,。但Real-time PCR的目的是為了讓目的基因按照理論值或是按照接近理論值進行擴增，只有這樣的擴增后續(xù)由Ct值推算出的起始量模板量才準確,，基于此,，Real-time PCR對非特異性擴增和引物二聚體的存在有較嚴格的要求。南京細胞Real-time PCR研究方案

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