聚合酶鏈反應(yīng)：在檢測(cè)病原體方面,病原體培養(yǎng)是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn) .但是對(duì)于一些苛養(yǎng)菌 生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌或難以培養(yǎng)的病原體等培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率不高.檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 無(wú)法滿足臨床早期快速診斷以指導(dǎo)醫(yī)治的需要[3],。當(dāng)前 PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn),，包括實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù) 、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR,、 PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ,、 巢式PCR等,。 在PCR技術(shù)的輔助作用下，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)也逐漸從生化免疫診斷過(guò)渡到基因診斷,，生化免疫檢測(cè)主要從表型表現(xiàn)評(píng)估病癥,，而基因診斷則深入本質(zhì)探究其病因，以PCR 技術(shù)為主的核酸技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與疾病診斷中表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用價(jià)值,，在未來(lái)的臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中必將會(huì)得到更加較廣的應(yīng)用,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒,、細(xì)菌,、菌類等。寧波血液定量PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)：PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ),。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。連云港特殊樣本定量PCR設(shè)計(jì)公司序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)放大簡(jiǎn)單重復(fù)序列之間的區(qū)域,，以產(chǎn)生擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的獨(dú)特指紋,。

聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增單個(gè)精子中幾個(gè)基因座的能力]增強(qiáng)了極大地增強(qiáng)了通過(guò)研究減數(shù)分裂后染色體交叉來(lái)進(jìn)行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù)。通過(guò)分析數(shù)千個(gè)單個(gè)精子,，已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見的交叉事件,。類似地，可以分析異常的缺失、插入,、易位或倒位,，所有這些都無(wú)需等待(或支付)漫長(zhǎng)而艱苦的受精,、胚胎發(fā)生等過(guò)程,。定點(diǎn)突變：聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因，突變由科學(xué)家隨意選擇,?？梢赃x擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能,。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。完整RNA 的提取和純化,，是進(jìn)行RNA 方面的研究工作,，如Nothern雜交、mRNA 分離,、RT-PCR,、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提,。所有ＲＮＡ的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),，即樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使白復(fù)合體變性,；對(duì)內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制,；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去,。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑，提取總核酸,，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來(lái),；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA 留在水相,。種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失,，目前該方法的使用頻率已很低。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè),，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法,。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DN段,，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克,、微克、毫克級(jí)的特異性DN段,。因此,，PCR技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域?！‘惓＝Y(jié)果： 各種疾病所致的異常,，例如梅毒。一期梅毒,。即硬下疳 ,，潛伏期2-4周，外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 ,、淺潰瘍 ,，有軟骨樣硬度，周圍淋巴結(jié)腫大,。二期梅毒,。在一期梅毒 1-2 個(gè)月之后，全身皮膚,、粘膜發(fā)生對(duì)稱泛發(fā)皮疹,、斑疹、,、疹等,。粘膜可發(fā)生粘膜斑、扁平濕疣,，傳染性強(qiáng),。三期梅毒。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年,，皮膚為樹膠樣腫,，還可涉及骨、關(guān)節(jié),、心,、血管，表現(xiàn)為主動(dòng)脈炎,、主動(dòng)脈瓣閉鎖不全和主動(dòng)脈瘤等,，侵及神經(jīng)為脊髓癆 ，全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等?！⌒枰獧z查的人群：疑似某種特定的疾病病人,，進(jìn)行分子特異性檢查。熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以通過(guò)將反應(yīng)組分加熱到變性溫度在加入聚合酶之前,。南京組織熒光PCR設(shè)計(jì)公司

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。寧波血液定量PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=-6）水平,。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞,；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）,；在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便,、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng),。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素,，無(wú)放射性污染,、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板,。可直接用臨床標(biāo)本如血液,、體腔液,、洗嗽液、毛發(fā),、細(xì)胞,、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。寧波血液定量PCR網(wǎng)站