聚合酶鏈式反應(yīng)：三步：變性：模板DNA加熱變性,；復性,，引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多,，使引物和模板在局部形成雜交鏈,；延伸,，4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下,，DNA合成酶催化以引物為起始點,，按5'-3'方向進行延伸,。上面三步為一個循環(huán)，可使拷貝數(shù)到達2*E－6-2*E－7,。PCR產(chǎn)物一段雙鏈DNA,，是由它的末端引物的5’端決定的。首輪擴增,，其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子,。長度應(yīng)大于兩引物之間的長度。在第二個循環(huán)中,，由于5'固定,，其產(chǎn)物長度就由等于兩引物之間的長度,。所以幾十個循環(huán)后就會產(chǎn)生大量的兩引物之間序列。聚合酶鏈式反應(yīng)準備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列,。南京組織RT-PCR檢測技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈式反應(yīng)：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性,，加入設(shè)計引物,，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床。上海血液熒光定量PCR聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能,。

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進頭等均應(yīng)一次性使用。必要時,，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后,，可擴增出PCR產(chǎn)物,，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。

聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是,，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴增的引物，需要關(guān)于目標序列的先前信息,。這意味著,，通常情況下，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標區(qū)域上游的精確序列,，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體,，并隨后在DNA合成過程中產(chǎn)生整個目標區(qū)域。像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯,，這反過來會導致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。PCR的另一個限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增,，導致誤導或模糊的結(jié)果。為了很大限度地減少污染的可能性,，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備,、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預留單獨的房間。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中,。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器,。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。

聚合酶鏈式反應(yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度,。在該步驟中,，DNA聚合酶通過從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈，在新生(伸長)DNA鏈的末端,，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合,。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標區(qū)域的長度。根據(jù)經(jīng)驗,，在很好溫度下,，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基,。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制),，在每個延伸/延伸步驟中,，DNA靶序列的數(shù)量加倍。隨著每一個連續(xù)的循環(huán),，原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈,，導致特定DNA目標區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴增。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的,，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍,。南京組織RT-PCR檢測技術(shù)服務(wù)

嵌套聚合酶鏈反應(yīng)：通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性,。南京組織RT-PCR檢測技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈式反應(yīng)的特點：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞,；在病毒的檢測中,，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中很小檢出率為3個細菌,。簡便,、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后,，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng),，一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,，不一定要用同位素,，無放射性污染、易推廣,。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液,、體腔液、洗嗽液,、毛發(fā),、細胞、活組織等DNA擴增檢測,。南京組織RT-PCR檢測技術(shù)服務(wù)