聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù),，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝,。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活,，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣,，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷,、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。嵌套聚合酶鏈反應(yīng)的兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。深圳實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商

聚合酶鏈反應(yīng)也可以用作以下敏感試驗(yàn)的一部分組織分型,，對(duì)移植至關(guān)重要,。截至2008年，甚至有人提議用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)取代傳統(tǒng)的血型抗體檢測(cè),。許多形式的病癥涉及致病基因的改變,。通過使用基于聚合酶鏈反應(yīng)的測(cè)試來研究這些突變，醫(yī)治方案有時(shí)可以根據(jù)患者的不同而不同,。聚合酶鏈反應(yīng)可以早期診斷惡性疾病,，如白血病和淋巴瘤，這是目前病癥研究中發(fā)展很快的,，并且已經(jīng)被常規(guī)使用,。PCR檢測(cè)可以直接在基因組DNA樣品上進(jìn)行，以檢測(cè)易位特異性惡性細(xì)胞,，其靈敏度至少是其他方法的10,，000倍。聚合酶鏈反應(yīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常有用,，因?yàn)樗试S分離和擴(kuò)增病癥抑制劑,。例如，定量PCR可以用于量化和分析單細(xì)胞,，以及識(shí)別DNA,、mRNA和蛋白質(zhì)的確認(rèn)和組合。深圳實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：定量PCR允許實(shí)時(shí)定量和檢測(cè)特定的DNA序列，因?yàn)樗诤铣蛇^程中測(cè)量濃度。有兩種方法可以同時(shí)檢測(cè)和定量,。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料,。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標(biāo)記的探針。只有在探針與其互補(bǔ)DNA雜交后,，才能使用這些方法檢測(cè)DNA,。一種有趣的技術(shù)組合是實(shí)時(shí)PCR和逆轉(zhuǎn)錄,。這種復(fù)雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR,，允許定量少量RNA。通過這種組合技術(shù),，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA,，并用qPCR進(jìn)一步定量。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應(yīng)終點(diǎn)出錯(cuò)的可能性,，增加了檢測(cè)與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機(jī)會(huì),。實(shí)驗(yàn)室使用RT-qPCR來靈敏地測(cè)量基因調(diào)控。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=-6）水平,。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中,，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）,；在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便,、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng),。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素,，無放射性污染,、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板,。可直接用臨床標(biāo)本如血液,、體腔液,、洗嗽液、毛發(fā),、細(xì)胞,、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul,、50ul?；?00ul,，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul 后,，再做大體積時(shí)，一定要模索條件,，否則容易失敗,。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低,，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象,，可以是病原體標(biāo)本如病毒,、細(xì)菌、菌類等,。莆田特殊樣本熒光定量PCR方案

聚合酶鏈反應(yīng)具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn),。深圳實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌,。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配,。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇,。模板即擴(kuò)增用的DNA,，可以是任何來源，但有兩個(gè)原則,，純度必須較高,，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系,，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系,；一價(jià)陽離子，一般采用鉀離子,，但在特殊情況下也可使用銨根離子,；二價(jià)陽離子，即鎂離子,，根據(jù)反應(yīng)體系確定,，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分,，常見的有DMSO,、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu),。深圳實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)供應(yīng)商