聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高,。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量,。循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量,，減少循環(huán)次數(shù),。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶,。退火溫度偏低,，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度,，減少變性與延伸時(shí)間,，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度,。 樣品處理不當(dāng),。Mg2+濃度偏高,，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒,，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題,。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生,。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶,。聚合酶鏈反應(yīng)具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)。南京微量熒光定量PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異),。它需要事先知道DNA序列,，包括等位基因之間的差異，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對(duì)緩沖液),。在模板和引物不匹配的情況下,，嚴(yán)格條件下的PCR擴(kuò)增效率要低得多，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴(kuò)增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性,。有關(guān)更多信息,，請(qǐng)參見(jiàn)單核苷酸多態(tài)性基因分型。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過(guò)對(duì)具有短重疊片段的長(zhǎng)寡核苷酸池進(jìn)行PCR來(lái)人工合成長(zhǎng)DNA序列,。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替,，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長(zhǎng)DNA產(chǎn)物,。徐州實(shí)時(shí)熒光PCR原理及步驟重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以創(chuàng)造特定的長(zhǎng)DNA構(gòu)建體,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊,。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列,，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾,。如附加限制酶位點(diǎn),，引入突變位點(diǎn)，用生物素,、熒光物質(zhì),、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列,，包括起始密碼子,、終止密碼子等,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性，模板DNA完全變性與PCR酶的完全對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要,，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū),，一般未修飾的Taq酶時(shí)間為兩分鐘。變性步驟,，循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間,。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性,，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗,。引物退火,，退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考,，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度,。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響,。引物延伸,，引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶很適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí),，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上,，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp,。循環(huán)數(shù)，大多數(shù)PCR含25-35循環(huán),，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增,。延伸，在一個(gè)循環(huán)后,，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全,，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。完整RNA 的提取和純化,，是進(jìn)行RNA 方面的研究工作,，如Nothern雜交,、mRNA 分離、RT-PCR,、定量PCR,、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),，即樣品細(xì)胞或組織的有效破碎,；有效地使白復(fù)合體變性；對(duì)內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制,；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離,；對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑,，提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來(lái),；直接在酸性條件下抽提,，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA 留在水相。種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失,，目前該方法的使用頻率已很低,。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)：一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。南京微量熒光定量PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。南京微量熒光定量PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù),，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝,。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈,。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣,，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷,、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。南京微量熒光定量PCR供應(yīng)商