聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補,、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）。序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)放大簡單重復(fù)序列之間的區(qū)域,，以產(chǎn)生擴增片段長度的獨特指紋,。連云港微量定量PCR研究方案

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：MgCl2濃度過高?？蛇m當(dāng)降低其用量,。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng,。引物濃度不夠優(yōu)化,。對引物進行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)過多,；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán),。退火溫度過低,。電泳體系有問題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；凝膠沒有凝固好,；瓊脂糖質(zhì)量差,。若為PCR試劑盒則可能：由于運輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效；試劑盒本身質(zhì)量有問題,，如引物選擇,、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布,。連云港微量定量PCR研究方案聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點：特異性強，PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,；堿基配對原則,；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；靶基因的特異性與保守性,。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵,。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性,，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進行,，結(jié)合的特異性增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度,。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),，其特異性程度就更高。

聚合酶鏈反應(yīng)：在檢測病原體方面,病原體培養(yǎng)是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn) .但是對于一些苛養(yǎng)菌 生長緩慢的細(xì)菌或難以培養(yǎng)的病原體等培養(yǎng)的陽性檢出率不高.檢測時間過長 無法滿足臨床早期快速診斷以指導(dǎo)醫(yī)治的需要[3],。當(dāng)前 PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)上進行的改進,，包括實時定量 PCR 技術(shù) 、 實時熒光定量PCR,、 PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗 ,、 巢式PCR等。 在PCR技術(shù)的輔助作用下,，實驗室檢測也逐漸從生化免疫診斷過渡到基因診斷,，生化免疫檢測主要從表型表現(xiàn)評估病癥，而基因診斷則深入本質(zhì)探究其病因,，以PCR 技術(shù)為主的核酸技術(shù)在臨床實驗室檢測與疾病診斷中表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用價值,，在未來的臨床醫(yī)學(xué)檢驗中必將會得到更加較廣的應(yīng)用,。熱啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴增的技術(shù)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：三步：變性：模板DNA加熱變性,；復(fù)性,，引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多,，使引物和模板在局部形成雜交鏈；延伸,，4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下,，DNA合成酶催化以引物為起始點，按5'-3'方向進行延伸,。上面三步為一個循環(huán),，可使拷貝數(shù)到達(dá)2*E－6-2*E－7。PCR產(chǎn)物一段雙鏈DNA,，是由它的末端引物的5’端決定的,。首輪擴增，其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子,。長度應(yīng)大于兩引物之間的長度,。在第二個循環(huán)中，由于5'固定,，其產(chǎn)物長度就由等于兩引物之間的長度,。所以幾十個循環(huán)后就會產(chǎn)生大量的兩引物之間序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu,，分別來自兩種不同的噬熱菌,。上海微量熒光PCR設(shè)計公司

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。連云港微量定量PCR研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加,。因此,，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā),、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA,，就能用PCR加以放大,，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在,。由1983年美國首先提出設(shè)想,，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。到2013年,，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。連云港微量定量PCR研究方案