聚合酶鏈式反應(yīng)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,，故又稱為基因的體外擴增法,。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DN段,，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克,、微克、毫克級的特異性DN段,。因此,，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域?！‘惓＝Y(jié)果： 各種疾病所致的異常,，例如梅毒。一期梅毒,。即硬下疳 ,，潛伏期2-4周，外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 ,、淺潰瘍 ,，有軟骨樣硬度，周圍淋巴結(jié)腫大,。二期梅毒,。在一期梅毒 1-2 個月之后，全身皮膚,、粘膜發(fā)生對稱泛發(fā)皮疹,、斑疹、,、疹等,。粘膜可發(fā)生粘膜斑、扁平濕疣,，傳染性強,。三期梅毒。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年,，皮膚為樹膠樣腫,，還可涉及骨、關(guān)節(jié),、心,、血管，表現(xiàn)為主動脈炎,、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等,，侵及神經(jīng)為脊髓癆 ，全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等,?！⌒枰獧z查的人群：疑似某種特定的疾病病人，進行分子特異性檢查。聚合酶鏈式反應(yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。連云港微量熒光定量PCR原理

聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是,，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴增的引物，需要關(guān)于目標序列的先前信息,。這意味著,，通常情況下，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標區(qū)域上游的精確序列,，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體,，并隨后在DNA合成過程中產(chǎn)生整個目標區(qū)域。像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯,，這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。PCR的另一個限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增,，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。為了很大限度地減少污染的可能性,，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備,、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨的房間。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中,。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器,。連云港微量熒光定量PCR原理聚合酶鏈反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶,、dNTP,、模板和緩沖液。

聚合酶鏈式反應(yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子,；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,，常用1.5mmol/L；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制,，20～200umol/L,；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L,；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù),；變性溫度和時間 95℃，30s,；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,，一般在45～55℃；延伸溫度和時間 72℃,，1min/kb(10kb內(nèi)）,；Tm值=4(G+C) +2(A+T),；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量,。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個左右,，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”,。

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室,，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高,，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,。其污染可能性也很大,。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測,，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施，防止和消除污染,。重復(fù)性試驗,。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。為了很大限度地減少污染的可能性,，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備,、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨的房間。

聚合酶鏈反應(yīng)：在檢測病原體方面,病原體培養(yǎng)是臨床診斷的金標準 .但是對于一些苛養(yǎng)菌 生長緩慢的細菌或難以培養(yǎng)的病原體等培養(yǎng)的陽性檢出率不高.檢測時間過長 無法滿足臨床早期快速診斷以指導(dǎo)醫(yī)治的需要[3],。當前 PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)上進行的改進,，包括實時定量 PCR 技術(shù) 、 實時熒光定量PCR,、 PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗 ,、 巢式PCR等。 在PCR技術(shù)的輔助作用下,，實驗室檢測也逐漸從生化免疫診斷過渡到基因診斷,，生化免疫檢測主要從表型表現(xiàn)評估病癥，而基因診斷則深入本質(zhì)探究其病因,，以PCR 技術(shù)為主的核酸技術(shù)在臨床實驗室檢測與疾病診斷中表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用價值,，在未來的臨床醫(yī)學(xué)檢驗中必將會得到更加較廣的應(yīng)用。流聚合酶鏈反應(yīng)：一種偽等溫PCR方法。黃山分子生物學(xué)定量PCR

聚合酶鏈式反應(yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標本如病毒,、細菌、菌類等,。連云港微量熒光定量PCR原理

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,，適當增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）,。連云港微量熒光定量PCR原理