蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎(chǔ),。離子交換纖維素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積,，使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過,。因此常用于蛋白質(zhì)的分離。 （1）羧甲基纖維素（CM-纖維素） 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團,。在中性pH條件下,，羧甲基上的質(zhì)子可解離下來（圖2-27a），而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結(jié)合,�,？山粨Q的基團帶正電，因此是一種陽離子交換劑,。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結(jié)合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引,。 (2）二乙氨基乙基纖維素（DEAE-纖維素） 在中性pH條件下，山東蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇,，它含有帶正電荷的基團,，可與溶液中的帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，山東蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇,，可交換的基團帶負電荷,，因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質(zhì)混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時,，帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結(jié)合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來,。帶負電荷的蛋白質(zhì)將被結(jié)合到柱上。結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引,。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫,，山東蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇，改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷,，依次從層析柱流出達到相互分離的目的,。山東蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇

三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法,。蛋白質(zhì)溶液在受到強大的離心力作用時,，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小,、密度和分子形狀有關(guān),，也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示,。 在離心場中，蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦力平衡時,，每單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數(shù)（Sedimentation Coefficient）,。上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位，用S表示,，以紀念超速離心法的創(chuàng)始人,，瑞典***的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg,。一個Svedberg單位（或直接稱一個S）為1×10一13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10一13～200×10一13s范圍內(nèi),，即1S～200S,。北京直銷蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇

三、蛋白質(zhì)分子量的測定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小,、所帶電荷的量以及分子形狀,。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基***鈉（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一種陰離子去污劑,，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基,。當?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS（一般加入量為0.1％）后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負電荷,，這些電荷量遠遠超過蛋白質(zhì)分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異,。所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長的橢園棒,，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比,。這樣,，消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小,。 進行凝膠電泳時,，常常用一種染料作前沿物質(zhì)，蛋白質(zhì)分子在電泳中的移動距離和前沿物質(zhì)移動的距離之比值稱為相對遷移率,，相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系,。以標準蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標準曲線,。將未知蛋白質(zhì)在同樣條件下電泳,，根據(jù)測得的樣品相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子量,。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.3. 親和層析 親和層析（affinity-chromatography）分離技術(shù)是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學(xué)基團具有專一性結(jié)合的原理,。這些能被生物大分子如蛋白質(zhì)所識別并與之結(jié)合的基團稱為配基或配體（ligand）。親和層析是一種有效的分離純化蛋白質(zhì)的方法,。例如酶對它的底物具有特殊的親和力,；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分離純化為例,，由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附,，因此可把葡萄糖通過適當?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面上。為了防止載體表面的空間位阻影響待分離的蛋白質(zhì)大分子與其配基的結(jié)合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂（或稱為間隔臂,，spacerarm）,，使配體與載體之間保持足夠的距離。 將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱,。當含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部,，并沿柱從上往下過時，待純化的蛋白質(zhì)與其特異性配基結(jié)合而被吸附到柱上,，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過柱子而流出（圖2-28a）,。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進行洗脫,，即可把該蛋白質(zhì)洗脫下來,，達到與其它蛋白質(zhì)分離的目的。

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.2 蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來,。抽提所用緩沖液的pH,、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定,。如膜蛋白的抽提,，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等）,，使膜結(jié)構(gòu)破壞,，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中,，應(yīng)注意溫度,，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性,。 2.3蛋白質(zhì)粗制品的獲得 選用適當?shù)姆椒▽⑺�要的蛋白質(zhì)與其它雜蛋白分離開來,。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法： 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質(zhì)的等電點不同,，可用等電點沉淀法使它們相互分離,。 2. 鹽析法 不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出,。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),，并能再度溶解而不變性。 3. 有機溶劑沉淀法 中性有機溶劑如乙醇,、丙酮,，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,，進而從溶液中沉淀出來,，因此可用來沉淀蛋白質(zhì),。此外，有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性,，使用該法時,，要注意在低溫下操作.直銷蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇

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蛋白質(zhì)分離純化步驟 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則： 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起，而且每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì),。許多蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu),、性質(zhì)上有許多相似之處，所以蛋白質(zhì)的分離提純是一項復(fù)雜的工作,。到目前為止,，還沒有一**成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一種較合適的分離純化程序以獲得高純度的制品,。且分離的關(guān)鍵步驟,、基本手段還是共同的。 蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量,，同時又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性,。因此，要分離純化某一種蛋白質(zhì),，先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料,。其次，應(yīng)設(shè)法避免蛋白質(zhì)變性,，以制備有活性的蛋白質(zhì),。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，純化操作都是在0～4℃的低溫下進行的,。同時也應(yīng)避免過酸,、過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。另外,，還要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白,，從而達到增加純度和提高產(chǎn)量的目的。山東蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇

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