蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.2 蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來(lái),。抽提所用緩沖液的pH,、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定,。如膜蛋白的抽提,，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等）,，使膜結(jié)構(gòu)破壞,，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中,，應(yīng)注意溫度,，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性,。 2.3蛋白質(zhì)粗制品的獲得 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺�要的蛋白質(zhì)與其它雜蛋白分離開來(lái),。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離。常用的有下列幾種方法： 1. 等電點(diǎn)沉淀法 不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離,。 2. 鹽析法 不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),，并能再度溶解而不變性,。 3. 有機(jī)溶劑沉淀法 中性有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮,，樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇,，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,，進(jìn)而從溶液中沉淀出來(lái),，因此可用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。此外,，樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇,，樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇，有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出,。由于有機(jī)溶劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性，使用該法時(shí),，要注意在低溫下操作.樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4 樣品的進(jìn)一步分離純化 用等電點(diǎn)沉淀法,、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品,。常用的純化方法有：凝膠過濾層析,、離子交換纖維素層析、親和層析等等,。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品,。 1. 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析（gel-filtration chromatography）又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠（Sephadex）裝入一個(gè)柱子中,，制成凝膠柱,。這種凝膠顆粒具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同,。當(dāng)把蛋白質(zhì)混合樣品加到凝膠柱中時(shí),，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則不能進(jìn)入被排阻在凝膠顆粒之外,。當(dāng)用洗脫液洗脫時(shí),，被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來(lái)，而比網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)可連續(xù)不斷地進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi),。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長(zhǎng),，而且受到來(lái)自凝膠內(nèi)部的阻力也很大，所以蛋白質(zhì)越小,，從柱子上洗脫下來(lái)所需時(shí)間越長(zhǎng),。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，進(jìn)入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同,，洗脫所用體積及時(shí)間不同,，從而達(dá)到分離的目的。北京樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)

蛋白質(zhì)分離純化步驟（二） 2.4.2 纖維素柱層析法 該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分離的基礎(chǔ),。離子交換纖維素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纖維素衍生物,，它具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積,，使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質(zhì)的分離,。 （1）羧甲基纖維素（CM-纖維素） 在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團(tuán),。在中性pH條件下，羧甲基上的質(zhì)子可解離下來(lái)（圖2-27a）,，而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負(fù)電荷結(jié)合,。可交換的基團(tuán)帶正電,，因此是一種陽(yáng)離子交換劑,。蛋白質(zhì)與離子交換纖維素之間結(jié)合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團(tuán)之間靜電吸引。 (2）二乙氨基乙基纖維素（DEAE-纖維素） 在中性pH條件下,，它含有帶正電荷的基團(tuán),，可與溶液中的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，可交換的基團(tuán)帶負(fù)電荷,，因此是一種陰離子交換劑,。當(dāng)某一蛋白質(zhì)混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時(shí)，帶正電荷的蛋白質(zhì)不能結(jié)合而隨著洗脫液的流動(dòng)先被洗脫下來(lái),。帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)將被結(jié)合到柱上,。結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團(tuán)間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行洗脫,，改變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷,，依次從層析柱流出達(dá)到相互分離的目的。

三,、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定的方法很多,，目前常用的方法有以下幾種。 3.1 凝膠過濾法 凝膠過濾法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理如“分離純化方法”中所 述,。一定型號(hào)的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙,，只允許較小的分子進(jìn)入膠粒，而大于孔隙的分子則不能進(jìn)入膠粒而被排阻在膠粒外面,。用洗脫液洗脫時(shí),，被排阻的分子量大的蛋白質(zhì)先被洗脫下來(lái)，隨后能夠進(jìn)入顆粒的蛋白質(zhì)也按分子量大小而先后被洗脫下來(lái)，分子量越小的越后被洗脫下來(lái),。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍,，在此范圍內(nèi)，分子量的對(duì)數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系,。因此,，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行層析分析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對(duì)它們的分子量的對(duì)數(shù)作圖,，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線,。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行層析分析，根據(jù)其所用的洗脫體積,，從標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量來(lái),。

三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 3.3 沉降法 沉降法又稱超速離心法,。蛋白質(zhì)溶液在受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí),，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小,、密度和分子形狀有關(guān),，也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。蛋白質(zhì)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速度用每單位時(shí)間內(nèi)顆粒下沉的距離來(lái)表示,。 在離心場(chǎng)中,，蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦力平衡時(shí)，每單位離心場(chǎng)強(qiáng)度的沉降速度稱為沉降系數(shù)（Sedimentation Coefficient）,。上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位,，用S表示，以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人,，瑞典***的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg,。一個(gè)Svedberg單位（或直接稱一個(gè)S）為1×10一13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在1×10一13～200×10一13s范圍內(nèi),，即1S～200S,。直銷蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇

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實(shí)驗(yàn)室及中試放大規(guī)模蛋白純化系統(tǒng) Unique Autopure系列蛋白純化系統(tǒng) 主要應(yīng)用領(lǐng)域 ： – 蛋白純化系統(tǒng)主要應(yīng)用于單抗、重組蛋白,、疫苗,、生化 藥、,、天然產(chǎn)物和多糖等生物制藥領(lǐng)域,。用于生物制品的下游工藝的分離純化。 Unique AutoPure 系列蛋白純化系統(tǒng) ： 產(chǎn)品特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)： – 模塊化設(shè)計(jì),，提供多個(gè)配置,，滿足特殊工藝流程需求 - 低脈動(dòng)高精度雙柱塞輸液泵 ,，優(yōu)異的分離重現(xiàn)性 ; – 全系統(tǒng)與液體接觸的地方均由生物兼容性材料組成、符合FDA,、USP VI等相關(guān)法規(guī)要求 ; – DAD全譜直讀檢測(cè)器,，避免了傳統(tǒng)的機(jī)械切換式檢測(cè)器所帶來(lái)的不穩(wěn)定性及高故障率 ; – 固定波長(zhǎng)檢測(cè)器燈為長(zhǎng)壽命LED燈，壽命大于8000小時(shí),，降低維護(hù)成本 ; – 專利技術(shù)紫外檢測(cè)器流通池,，低死體積、低峰拓展,，提高了色譜分離度 ; – 高靈敏度在線pH,、電導(dǎo)率、紫外檢測(cè)器,，低死體積,、低峰拓展，提高了色譜分離度 ; – 集中了buffer選擇閥,，自動(dòng)進(jìn)樣閥、柱位閥等自動(dòng)化組件,，提高了純化的自動(dòng)化程度 ; – 具有柱前,、柱后、壓差報(bào)警,，氣泡傳感器檢測(cè)等功能,，大的保護(hù)了系統(tǒng)及層析柱的安全性 ; – 層析工作站軟件是一款功能強(qiáng)大、性能,、高穩(wěn)定性的色譜數(shù)據(jù)管理系樣品前處理蛋白純化系統(tǒng)高品質(zhì)的選擇

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