流式細胞技術是細胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法,其用于外泌體定量檢測的準確性也在不斷上升,。將外泌體表面特異性標志物CD63,、CD81等相應抗體進行標記,可用流式細胞儀檢測到陽性表達,,從而實現對外泌體的定量。但流式細胞技術檢測時需要單顆粒懸浮液,,當外泌體濃度高或分離過程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時將導致一次觀察到多個顆粒,,從而導致數據不準確。因此,,為了通過流式細胞儀觀察,,需要將外泌體通過免疫捕獲或共價結合固定在磁珠表面上,從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預期在外泌體表面表達的抗原的熒光偶聯抗體中,。在流式細胞術之前,,可以在落射熒光顯微鏡(EPI)下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯的外泌體囊泡。當樣品通過流式細胞儀時采集熒光信號,,不只可以對外泌體進行高通量分析,,還可以基于抗原表達對外泌體進行定量或分類。外泌體中常見的細胞質蛋白是Rabs蛋白,,是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種,。外泌體內容物的進入或外泌體信號的誘導可能涉及配體受體誘導的細胞內信號或融合。湖南CD9外泌體慢病毒包裝
Exosome,,中文名外泌體,,是一種能被大多數細胞分泌的微小膜泡,具有脂質雙層膜結構,,直徑大約40-100nm,。盡管外泌體較初在1983年就被發(fā)現,但人們一直認為它只是一種細胞的廢棄物,。然而較近幾年,,人們發(fā)現這種微小膜泡中含有細胞特異的蛋白、脂質和核酸,,能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能,。這些發(fā)現點燃了人們對細胞分泌膜泡的興趣。2015年,,隨著精確醫(yī)學概念的提出,,越來越多的人開始關注如何能做到疾病的精確診斷和診療,。外泌體作為一個新型的研究熱點,由于它在體內存在的普遍性和獲取的便捷性,,已經成為了疾病診斷診療的潛在有效方式,,在精確醫(yī)學發(fā)展上有著光明的前景。外泌體的提取的方式:超速離心法,。外泌體亞型外泌體內主要含有核酸,、蛋白質和脂質等,可作為疾病診斷標記物,、調控靶細胞功能,、參與細胞生物學活動等。
酶聯免疫吸附測定(ELISA):將其中一種針對外泌體表面抗原的抗體固定在微孔板的表面上,,將外泌體樣品暴露于含有固定抗體的孔中,,由于抗體-抗原相互作用,表達抗原的外泌體將被捕獲固定在板上,。將未捕獲的樣品內容物洗掉,,并使用另一種抗體檢測固定的外泌體。ELISA已用于從尿液,、血漿和血清中分離出外泌體,,當使用標準液(已知外泌體的量)創(chuàng)建標準曲線時,甚至可以進行定量,。但是,,此方法需要通過超速離心或超濾對樣品進行預處理。同樣,,流場-流分離與紫外線分析儀和光散射檢測器相結合已被用于分析外泌體的大小和純度,。外泌體屬于胞外囊泡類,除了外泌體之外細胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡,。
外泌體研究背景:胞外囊泡是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡狀小體,,主要由微囊泡、凋亡小體,、外泌體組成,。而外泌體是其中一類小囊泡,直徑為30~150nm,,密度1.10~1.18g/ml,,可攜帶核酸、蛋白質質和脂質等,,存在于血液,、唾液、尿液等多種體液中。越來越多的研究證實,,外泌體可以通過細胞間轉移核酸,、蛋白質、脂質等特定物質,,發(fā)揮特殊的功能,。如在抗原提呈細胞中呈遞抗原程中、肉瘤細胞發(fā)生了發(fā)展,、神經細胞信號轉導過程中都發(fā)揮著重要作用,。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析,。一個推測的作用是外泌體可能從細胞中去除多余和/或不必要的成分以維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定,。
內化的外泌體和內源性產生的外泌體的細胞旅程:外泌體可以通過不同的機制直接進入細胞。外泌體由細胞通過內吞作用過程從頭生成,。外泌體不斷地被細胞產生和吸收,。它們可能是新生成的外泌體和消耗的外泌體的混合物。目前尚不清楚內生性產生或消耗的外泌體是一起釋放還是單獨釋放,。被吸收的外泌體會被溶酶體降解。進入細胞的外泌體可能進入或與已存在的ESEs融合,,隨后解體并將其內容物釋放到細胞質中,。另外,內泌體可以與質膜融合并在細胞外釋放外泌體,。外泌體天然存在于體液中,,包括血液、唾液,、尿液,、腦脊液和乳汁中。血清外泌體提取超速離心
NTA技術已被作為外泌體表征手段之一,。湖南CD9外泌體慢病毒包裝
透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)是用于評估外泌體形態(tài),、大小和表型的的兩種常見的電子顯微鏡。SEM和TEM均使用電子束產生高分辨率的亞微米顆粒放大圖像,,以區(qū)分外泌體與殘留在樣品中相似大小的非外泌體顆粒,,該方法還可用于檢查樣品的純度。TEM與SEM之間的區(qū)別在于檢測電子類別,,在SEM中,,電子與樣品中的粒子相互作用時會發(fā)生散射,捕獲并檢測散射的電子,,從而生成粒子圖像,。但是,在TEM中,不與粒子相互作用的電子穿過樣品,,并使用熒光屏進行檢測,。電子顯微鏡下外泌體大小不一,通常呈茶托樣的圓形或橢圓形,。采用電子顯微鏡檢測外泌體時對樣品的預處理和制備要求較高,,外泌體的提取方法和品質會對電鏡結果造成影響;另外樣品的準備階段比較復雜,,不適合進行大量快速的測量,;而且由于樣本經過了干燥、固定以及冷凍等預處理和制備過程,,對生物樣本的結構會造成一定的破壞,,從而影響觀察的效果,無法準確測量外泌體濃度,。湖南CD9外泌體慢病毒包裝
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