流式細胞技術是細胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法，其用于外泌體定量檢測的準確性也在不斷上升,。將外泌體表面特異性標志物CD63,、CD81等相應抗體進行標記，可用流式細胞儀檢測到陽性表達，從而實現對外泌體的定量,。但流式細胞技術檢測時需要單顆粒懸浮液,，當外泌體濃度高或分離過程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時將導致一次觀察到多個顆粒，從而導致數據不準確,。因此,，為了通過流式細胞儀觀察，需要將外泌體通過免疫捕獲或共價結合固定在磁珠表面上,，從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預期在外泌體表面表達的抗原的熒光偶聯抗體中,。在流式細胞術之前，可在落射熒光顯微鏡（EPI）下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯的外泌體囊泡,。當樣品通過流式細胞儀時采集熒光信號,，不只可以對外泌體進行高通量分析，還可以基于抗原表達對外泌體進行定量或分類,。外泌體具有相似布朗運動的蛋白質聚集體,，因此無法排除其他物質干擾。腦脊液外泌體芯片

外泌體（Exosomes）是細胞分泌到胞外的一種囊泡（ExtracellularVesicles,，EVs）,，其大小為30-150nm，具有雙層膜結構和茶托狀形態(tài),，含有豐富的內含物（包括核酸,、蛋白和脂質等），參與細胞間的分子傳遞,。外泌體普遍存在于細胞培養(yǎng)上清以及各種體液中,，包括血液、唾液,、尿液,、乳汁等，同時也存在于組織樣本中,，如腦組織,、肌肉組織、脂肪組織等,。腦組織分離方法簡述：將腦組織剪成薄片,，放入離心管中加上消化液進行消化，經水浴,、反復輕輕上下顛倒,，再用移液間斷緩慢吹吸至消化結束。隨后加入培養(yǎng)基于消化液中,，混勻,，置于冰上。再進行一系列的差速超速離心過程，包括除雜,、濾膜過濾,、超離等。結尾用PBS重懸外泌體,，用重懸后的外泌體進行下面的透射電鏡（TEM）,、納米粒徑追蹤分子（NTA）和markerWB鑒定。體液外泌體Dir外泌體的提取的方式：PS親和法,。

外泌體攜帶大量特異性的蛋白質（如細胞因子,、生長因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質,，在體內參與細胞通訊,、細胞遷移、促血管新生和抗瘤子免疫等生理過程,，與多種疾病的發(fā)生和進程密切相關,。由于外泌體的特殊結構和功能，使得它具有潛在的應用價值,，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標,，另一方面也可以作為診療手段，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床診療,。外泌體研究,，應選用血漿還是血清？答：血清是血液凝固之后收集的液體,，所以其中少了纖維蛋白原,，凝血因子，以及多了比較多凝血產物,。纖維蛋白原可轉化為纖維蛋白,，具有凝血功能。在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體,，有研究發(fā)現血清中有接近50%的外泌體來自額外的分泌,。

外泌體的生物發(fā)生和鑒定。液體和細胞外成分,，如蛋白質,、脂類,、代謝物,、小分子和離子，可以通過內吞作用和質膜內陷,，與細胞表面蛋白一起進入細胞,。由此產生的胞腔側質膜芽的形成表現為質膜的外-內取向。這一出芽過程導致芽的形成可能與內質網、跨高爾基網絡(TGN)和線粒體預先形成的早期核內體融合,。ESEs也可以與ER和TGN融合,，這可能解釋了內吞物如何到達它們的。因此,，一些ESEs可以包含膜和腔的成分,，可以表示不同的起源。外泌體表面蛋白包括四聚體蛋白,、整合蛋白,、免疫調節(jié)蛋白等。外泌體可以包含不同類型的細胞表面蛋白,、細胞內蛋白,、RNA、DNA,、氨基酸和代謝物,。外泌體產生相關的重要分子：Ral、ARF6,、PLD2,、RAB家族。

PEG沉淀法分離外泌體：通常通過將無水聚合物,，如聚乙二醇（PEG）,，與樣品混合來沉淀外泌體。PEG聚合物競爭性結合水分子,，增加疏水性蛋白和脂質分子的相互結合力從而沉淀外泌體,，然后通過離心分離外泌體。這種分離的方法快速,，簡便,，可用于各種起始體積（從100μL到幾毫升）適合于各種研究和臨床設定。然而,，這種方法缺乏選擇性,，PEG聚合物不只會導致外泌體小泡沉淀，還會引起其他細胞外囊泡,、細胞外蛋白質和蛋白質聚集體沉淀,。因此，在使用這種方法之前,，必須進行樣品預處理,，例如過濾或超速離心，以減少較終的外泌體制劑的污染,。疾病的進展和對診療的反應可以通過外泌體的多組分分析來確定,。吉林CD63外泌體慢病毒

度梯度離心法,，用此種方法分離到的外泌體純度高。腦脊液外泌體芯片

細胞外小泡通過充當脂肪組織,、肝臟,、骨骼肌和免疫細胞之間的細胞間通訊方式，在肥胖及其代謝并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮作用,。外泌體可能在外周胰島素敏感性的調節(jié)中起作用,，外周胰島素敏感性是T2D發(fā)病機理的主要組成部分。外泌體似乎通過至少兩種不同的機制來調節(jié)胰島素敏感性,，即通過調節(jié)炎癥或通過與胰島素反應性部位的直接相互作用,。后者可通過與主要胰島素信號分子（例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號通路）相互作用而影響胰島素信號通路而直接或間接發(fā)生。與對照組相比,，糖尿病患者的血漿EV含量更高,，并且與對照組相比，糖尿病小鼠的血漿外泌體數量也更高,。然而,，確定外泌體的作用及其在肝/腸軸通訊中的潛在作用將需要對它們的組成有更好的了解，特別是飲食是否會改變腸源性外泌體的含量,，因此就胰島素反應而言它們的生物學功能尚未研究,。腦脊液外泌體芯片

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