外泌體的提取、純化和鑒定：每一個(gè)外泌體研究者較初都要為外泌體的分離提取而煩惱,。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體,，并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體。另外利用外泌體自身的物理化學(xué)性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達(dá)到分離效果,。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)（電子顯微鏡技術(shù)）,、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實(shí)現(xiàn)的,。近來的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在比較多生理病理上起著重要的作用,，如免疫中抗原呈遞、瘤子的生長與遷移,、組織損傷的修復(fù)等,。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物,。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),，能比較好的保護(hù)其包被的物質(zhì)，且能靶向特定細(xì)胞或組織,，因此是一種比較好靶向給藥系統(tǒng),。腹水外泌體融合實(shí)驗(yàn)外泌體的膜蛋白有可能與細(xì)胞膜蛋白作用，活躍細(xì)胞內(nèi)通路,。超離法是較常用的外泌體純化手段,。外泌體差速離心法提取過程

根據(jù)內(nèi)侵量的不同，可以產(chǎn)生不同尺寸,、不同含量的ILV,。LSEs產(chǎn)生的MVBs具有確定的ILV聚集(未來的外泌體)。MVBs可以與自噬體融合,，較終其內(nèi)容物在溶酶體中降解,。降解產(chǎn)物可被細(xì)胞回收利用。MVBs也可以直接與溶酶體融合降解,。不遵循這一軌跡的MVBs可通過細(xì)胞骨架和微管網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜,，借助mvb-?？康鞍淄？吭谫|(zhì)膜的腔側(cè),。隨后胞吐導(dǎo)致具有與質(zhì)膜相似的脂質(zhì)雙分子層方向的外泌體的釋放,。有幾種蛋白參與了外泌體的生物發(fā)生，包括RabGTPases,、ESCRT蛋白,，以及其他也被用作外泌體標(biāo)記的蛋白(CD9、CD81,、CD63,、flotillin、TSG101,、神經(jīng)酰胺和Alix),。遼寧CD81外泌體慢病毒包裝外泌體的膜同細(xì)胞一樣，是磷脂雙分子層,。

外泌體是分泌的細(xì)胞外囊泡的主要群體,，是具有生物活性的脂雙層囊泡，大小約為30-100nm,，由不同類型的正常細(xì)胞和瘤子細(xì)胞自然產(chǎn)生和釋放,。這些囊泡在細(xì)胞間通訊中起重要作用，并影響細(xì)胞外環(huán)境和免疫系統(tǒng)反應(yīng),。外泌體通過內(nèi)體途徑分泌到細(xì)胞外空間,，并將各種生物活性分子（貨物）轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞。外泌體貨物的組成非常多樣化,，包括各種免疫阻止和免疫刺激蛋白,、趨化因子、細(xì)胞因子,、細(xì)胞受體,、脂質(zhì)以及不同的核酸，例如miRNA和環(huán)狀RNA,。

外泌體的來源與特征：外泌體是一種存在于細(xì)胞外的多囊泡體,，通過細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成，其大小均一,，直徑為40-100nm,，密度為1.10-1.18g/mL。外泌體可由間充質(zhì)干細(xì)胞,、淋巴細(xì)胞和肉瘤細(xì)胞等多種類型細(xì)胞主動(dòng)分泌釋放,。外泌體內(nèi)主要含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，可作為疾病診斷標(biāo)記物,、調(diào)控靶細(xì)胞功能,、參與細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)等。例如：含有miR-140-5p的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(SMSC-Exo影響軟骨組織再生,；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體攜帶的miR-196a可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化促進(jìn)大鼠顱骨缺損的骨再生,。外泌體的直徑比微泡的要小，后者直徑為100nm-1μm,。

外泌體的提取主要包括以下幾種方式,。一是超速離心法，這是目前外泌體提取較常用的方法,。此種方法得到的外泌體量多,，但是純度不足，電鏡鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊,，由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn),，也有一些研究認(rèn)為此種方法得到的是微泡不是外泌體。二是過濾離心,，這種操作簡單,、省時(shí)，不影響外泌體的生物活性,，但同樣存在純度不足的問題,。三是密度梯度離心法，用此種方法分離到的外泌體純度高,，但是前期準(zhǔn)備工作繁雜,，耗時(shí),，量少,。外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體,。山東CD63外泌體慢病毒包裝

多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體,。外泌體差速離心法提取過程

外泌體（Exosomes）是細(xì)胞分泌到胞外的一種囊泡（ExtracellularVesicles，EVs）,，其大小為30-150nm,，具有雙層膜結(jié)構(gòu)和茶托狀形態(tài)，含有豐富的內(nèi)含物（包括核酸,、蛋白和脂質(zhì)等）,，參與細(xì)胞間的分子傳遞。外泌體普遍存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中,，包括血液,、唾液、尿液、乳汁等,，同時(shí)也存在于組織樣本中,，如腦組織、肌肉組織,、脂肪組織等,。腦組織分離方法簡述：將腦組織剪成薄片，放入離心管中加上消化液進(jìn)行消化,，經(jīng)水浴,、反復(fù)輕輕上下顛倒，再用移液間斷緩慢吹吸至消化結(jié)束,。隨后加入培養(yǎng)基于消化液中,，混勻，置于冰上,。再進(jìn)行一系列的差速超速離心過程,，包括除雜、濾膜過濾,、超離等,。結(jié)尾用PBS重懸外泌體，用重懸后的外泌體進(jìn)行下面的透射電鏡（TEM）,、納米粒徑追蹤分子（NTA）和markerWB鑒定,。外泌體差速離心法提取過程

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