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AFC自動(dòng)收集器是將qEV分離法這一過(guò)程自動(dòng)化的儀器,,將用來(lái)收集外泌體樣本的微量離心管放置在AFC的中間轉(zhuǎn)盤(pán)內(nèi),,根據(jù)稱(chēng)重精確測(cè)量流體體積,可精確的測(cè)量到樣品中每一個(gè)液滴的重量并精確測(cè)量總重量,。將在空隙體積之前從qEV柱洗脫的流體收集到AFC轉(zhuǎn)盤(pán)的單獨(dú)中心孔中并送至廢液桶,,避免將不需要的空隙部分收集到微量離心管中。在提取期間,,當(dāng)達(dá)到設(shè)定的提取體積后,,轉(zhuǎn)盤(pán)會(huì)自動(dòng)旋轉(zhuǎn)到下一個(gè)微量離心管繼續(xù)收集,到收集完成后自動(dòng)停止,。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)不佳有效提高了核酸分子的擴(kuò)增效率,,而且由于采用微滴計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量,可以不依賴(lài)與RT-PCR的熒光信號(hào)和Ct值,對(duì)所測(cè)樣品中的核酸分子進(jìn)行一定定量,。在凝血過(guò)程中血小板會(huì)分泌大量的外泌體,,有研究發(fā)現(xiàn)血清中有接近50%的外泌體來(lái)自額外的分泌。福建外泌體label free
磁珠免疫法分離外泌體:將針對(duì)目的抗原的抗體通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,,然后將磁珠與樣品共孵育,,使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物,再用蒸餾水或者PBS沖洗,,結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體,。該方法相對(duì)于ELISA的好處主要是,珠粒提供了更大的表面積來(lái)捕獲外泌體,,從而提高了分離效率,。此外,使用磁珠時(shí),,樣品起始體積沒(méi)有上限,,而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染,。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí),,磁珠法可分離出更純凈的外泌體,特異性高,、速度更快,,并且不需要昂貴的儀器。另外,,與其他分離方法(如超速離心或超濾)相比,,磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時(shí),,外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響,。福建外泌體label free外泌體天然存在于體液中,包括血液,、唾液,、尿液、腦脊液和乳汁中,。
外泌體的提取主要包括以下幾種方式,。一是超速離心法,這是目前外泌體提取較常用的方法,。此種方法得到的外泌體量多,,但是純度不足,電鏡鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊,,由于微泡和外泌體沒(méi)有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn),也有一些研究認(rèn)為此種方法得到的是微泡不是外泌體。二是過(guò)濾離心,,這種操作簡(jiǎn)單,、省時(shí),不影響外泌體的生物活性,,但同樣存在純度不足的問(wèn)題,。三是密度梯度離心法,用此種方法分離到的外泌體純度高,,但是前期準(zhǔn)備工作繁雜,,耗時(shí),量少,。
外泌體研究背景:胞外囊泡是從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體,,主要由微囊泡、凋亡小體,、外泌體組成,。而外泌體是其中一類(lèi)小囊泡,直徑為30~150nm,,密度1.10~1.18g/ml,,可攜帶核酸、蛋白質(zhì)質(zhì)和脂質(zhì)等,,存在于血液,、唾液、尿液等多種體液中,。越來(lái)越多的研究證實(shí),,外泌體可以通過(guò)細(xì)胞間轉(zhuǎn)移核酸、蛋白質(zhì),、脂質(zhì)等特定物質(zhì),,發(fā)揮特殊的功能。如在抗原提呈細(xì)胞中呈遞抗原程中,、腫細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生了發(fā)展,、神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。對(duì)外泌體的分析和檢測(cè)可以輔助疾病的早期診斷,、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后分析,。外泌體膜可以與靶細(xì)胞膜直接融合,非選擇性的釋放其所含的蛋白質(zhì),、mRNA以及microRNA,。
外泌體的提取、純化和鑒定:每一個(gè)外泌體研究者較初都要為外泌體的分離提取而煩惱,。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體,,并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體,。另外利用外泌體自身的物理化學(xué)性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達(dá)到分離效果。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)(電子顯微鏡技術(shù)),、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實(shí)現(xiàn)的,。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在比較多生理病理上起著重要的作用,如免疫中抗原呈遞,、瘤子的生長(zhǎng)與遷移,、組織損傷的修復(fù)等。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能,,可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物,。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),能比較好的保護(hù)其包被的物質(zhì),,且能靶向特定細(xì)胞或組織,,因此是一種比較好靶向給藥系統(tǒng)。外泌體分離之后,,需要經(jīng)過(guò)一系列鑒定才能確定分離的是外泌體,。細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒原理
外泌體較有用的特性之一是它們穿過(guò)屏障(如細(xì)胞質(zhì)膜和血/腦屏障)的能力。福建外泌體label free
質(zhì)膜的連續(xù)內(nèi)陷較終導(dǎo)致多泡體的形成,,多泡體可與細(xì)胞內(nèi)的其他囊泡和細(xì)胞器交叉,,從而增加了外泌體成分的多樣性。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源的不同,,細(xì)胞外囊泡,,包括外泌體,可以包含細(xì)胞的許多成分,,包括DNA,、RNA、脂質(zhì),、代謝物,、胞質(zhì)和細(xì)胞表面蛋白。目前產(chǎn)生外泌體的生理目的尚不清楚,,需要進(jìn)一步研究,。一個(gè)推測(cè)的作用是外泌體可能從細(xì)胞中去除多余和/或不必要的成分以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。較近的研究也表明外泌體中特定細(xì)胞成分的功能,、靶向,、機(jī)制驅(qū)動(dòng)的積累,提示它們?cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用,。福建外泌體label free
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