單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組關(guān)鍵步驟：?jiǎn)渭?xì)胞的分離和捕獲：溫和分離,，稀有細(xì)胞,。轉(zhuǎn)錄本的捕獲和擴(kuò)增：RNA測(cè)序需要0.1-1.0ug total RNA，捕獲效率10%（5-**NA測(cè)序需要1ng DNA,，極限稀釋加移液分離單細(xì)胞,；顯微操作分選單細(xì)胞；流式分選帶有表面Marker的單細(xì)胞,；激光切割實(shí)體組織,；微流控技術(shù)；磁珠捕獲,，主要用于CTC,。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)基本概念：普通轉(zhuǎn)錄組的思路也可以應(yīng)用到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。普通轉(zhuǎn)錄組相當(dāng)于把一群細(xì)胞混合到一起去提取RNA,，獲得的是每個(gè)細(xì)胞中RNA表達(dá)量的平均值,。單細(xì)胞是把每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)分出來(lái)去提取RNA，然后建庫(kù)測(cè)序,，獲得是是單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)值,。在每個(gè)細(xì)胞里面基因的表達(dá)具有隨機(jī)性，且存在異質(zhì)性,?；诟咄繙y(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)能夠全方面獲得物種特定組織的轉(zhuǎn)錄本信息。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析

轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域：農(nóng)林領(lǐng)域：生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制,，抗逆脅迫機(jī)制,，育種，物種保護(hù)研究等,；畜牧業(yè)：生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制,，致病機(jī)理研究，肉類(lèi)及乳制品品質(zhì)研究等,；海洋水產(chǎn)：生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制,，漁業(yè)資源，漁業(yè)環(huán)境與水產(chǎn)品安全等,；微生物：致病機(jī)理,，耐藥機(jī)制，病原體-宿主相互作用研究等,；生物醫(yī)藥：生物標(biāo)志物,，疾病機(jī)理機(jī)制，疾病分型,，藥物開(kāi)發(fā),，個(gè)性化醫(yī)治等；環(huán)境科學(xué)：發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化,，生物燃料生產(chǎn),，環(huán)境危害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究等；食品科學(xué)：食品儲(chǔ)藏及加工條件優(yōu)化,，食品組分及品質(zhì)鑒定,，功能性食品開(kāi)發(fā)，食品安全監(jiān)檢測(cè)等,。濟(jì)南宏轉(zhuǎn)錄學(xué)組轉(zhuǎn)錄組學(xué)有高通量,、更精確的數(shù)字信號(hào)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序流程：1,、樣品RNA準(zhǔn)備,。2、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建,。3,、DNA成簇(Cluster)擴(kuò)增。4,、高通量測(cè)序(Illumina),。5、數(shù)據(jù)分析,。轉(zhuǎn)錄組的分析大致有以下幾種情況：1,、同一物種在發(fā)育過(guò)程中的各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的基因表達(dá)特點(diǎn)及存在的差異；2,、不同品系之間存在的差異表達(dá)基因,；3、不同的外界條件處理,，如細(xì)菌,、病毒,、光照、紫外,、干旱,、高溫、高鹽脅迫,，對(duì)基因表達(dá)的影響,；4、同一個(gè)體,，不同組織之間的基因表達(dá)差異,。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況,。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序比其他研究方法有哪些優(yōu)勢(shì)?轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）可以直接測(cè)定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本片段序列,、單核苷酸分辨率的準(zhǔn)確度，同時(shí)不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號(hào)帶來(lái)的交叉反應(yīng)和背景噪音問(wèn)題,；（2）靈敏度高,，可以檢測(cè)細(xì)胞中少至幾個(gè)拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本；（3）可以對(duì)任意物種進(jìn)行全基因組分析,，無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針,，因此無(wú)需了解物種基因信息，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,，同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因,，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并準(zhǔn)確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)及cSNP,，UTR區(qū)域,。（4）檢測(cè)范圍廣，高于6個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍,，能夠同時(shí)鑒定和定量稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本,。轉(zhuǎn)錄學(xué)組測(cè)序可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)。

circRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)：是一類(lèi)具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子,，沒(méi)有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly（A）結(jié)構(gòu),，主要位于細(xì)胞質(zhì)或儲(chǔ)存于外泌體中，不受RNA外切酶影響,，表達(dá)更穩(wěn)定且不易降解,，已被證明普遍存在于多種真核生物體內(nèi)[1]。大多數(shù)circRNA是由外顯子環(huán)化而成,，也有部分circRNA是由內(nèi)含子環(huán)化而成的套索結(jié)構(gòu),。同時(shí)由于circRNA含有大量的miRNA應(yīng)答原件（MREs），能與AGO蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的催化關(guān)鍵，然后導(dǎo)致circRNA降解,。根據(jù)來(lái)源,，circRNA可大致分為四類(lèi)：全外顯子型的circRNA，內(nèi)含子和外顯子組合的EIcircRNA,，內(nèi)含子組成的套索型ciRNA,，由病毒RNA基因組、tRNA,、rRNA、snRNA等環(huán)化產(chǎn)生的circRNA,。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可應(yīng)用于疾病標(biāo)志物篩查,、疾病的診斷和分型、疾病復(fù)發(fā)診斷,。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析

轉(zhuǎn)錄組學(xué)無(wú)需了解物種基因信息,，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)：Anydeplete技術(shù)首先通過(guò)隨機(jī)引物進(jìn)行一鏈合成,，一鏈合成引入核苷酸類(lèi)似物,，用于酶切打斷，二鏈合成同樣引入核苷酸類(lèi)似物用于保證鏈特異性,。然后兩端加上接頭,，接頭一條鏈也帶有核苷酸類(lèi)似物，用于酶切降解,。當(dāng)形成單鏈文庫(kù)后,，設(shè)計(jì)特異性引物與rRNA形成文庫(kù)結(jié)合，一輪退火延伸,，rRNA文庫(kù)形成雙鏈結(jié)構(gòu),。Reverseadaptor上帶有特異的酶切位點(diǎn)，當(dāng)形成雙鏈結(jié)構(gòu)酶切位點(diǎn)被識(shí)別,，切去接頭,，這樣rRNA形成的文庫(kù)不帶有完整的接頭，而其他文庫(kù)帶有完整接頭,，通過(guò)PCR擴(kuò)增富積既能得到想要的信息,，包含mRNA及LncRNA信息。同樣Anydeplete技術(shù)與10×genomics技術(shù)一樣,，包含分子標(biāo)簽,，可分析duplication及PCR產(chǎn)生突變位點(diǎn)。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析