細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟盡量避光,。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間,，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周,。無/弱染色：烤片溫度過高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過低,，孵育是否時(shí)間過短等。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程,。AIRE-1免疫熒光分析

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對(duì)于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理,，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，操作小心,，防止細(xì)胞脫片。對(duì)于懸浮細(xì)胞：有2種方法,，①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟,，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上,。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟,，離心洗脫,，然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟。對(duì)于冷凍切片：切片放置在載玻片上后,，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作,。對(duì)于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理,。SERPINF1免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位。

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù),。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液,，計(jì)數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細(xì)胞生長速度快慢,，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,。在1941年，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃,，室溫避光孵育1小時(shí),。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行,。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì),。AIRE-1免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選,。AIRE-1免疫熒光分析

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1、建議細(xì)胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2,、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片,。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng),，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜,，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。AIRE-1免疫熒光分析

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