細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號(hào)弱或者無信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過長(zhǎng),；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索,；3）一抗孵育時(shí)間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育。2,、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過高；抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度過高,；清洗不充分,；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù),。IL-6免疫熒光染色

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h,，時(shí)間過長(zhǎng),，會(huì)使熒光減弱。2）每次試驗(yàn)時(shí),，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥,。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失,，從而造成非特異性熒光染色,。ALBUMIN免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原,，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體,，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng),，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,，干燥,、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,，則表明抗原標(biāo)本是已知的,，待檢血清為一抗體，其它步驟的抗原檢查相同,。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),，因此,，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,，以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片,，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長(zhǎng),，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大,；與直接免疫熒光相比,，通過信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基,，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min,。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘,。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）,。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度）,，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇,。NLRP3免疫組化IHC

在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。IL-6免疫熒光染色

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí),，動(dòng)作應(yīng)輕柔,，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過程中,，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過密,。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi),，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照,。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。IL-6免疫熒光染色

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