細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高、速度快的特點(diǎn),，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實驗技術(shù),，用于檢測和定位特定抗原或抗體。CD42b免疫組化

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。四乙基羅丹明（rhodamine,，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光。CD42b免疫組化熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原,，也可以用于檢測和定位抗體,。

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打,，使之成單細(xì)胞懸液，計數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板,，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上,，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時爬片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后,，根據(jù)細(xì)胞生長速度快慢，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì)，會產(chǎn)生背景熒光,，對結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對樣品進(jìn)行觀察,，確保抗原本身沒有信號,。2,、陽性對照：用確認(rèn)含有待測抗原的組織或細(xì)胞，與待測標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性,，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3,、陰性對照：與陽性對照相反,，用明確不含有待測抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）,、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣,。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計,、流式細(xì)胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實驗,。CX43免疫組化

免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。CD42b免疫組化

基于熒光成像的技術(shù)對于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用,。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時,，熒光成像技術(shù)的分析能力增加，增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實用性,，使其成為寶貴的工具,。免疫熒光顯微鏡通過使活細(xì)胞成像能夠可視化整個細(xì)胞器，徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域,。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù),。免疫熒光（IF）是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù)，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體,。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原,；可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài),；并分析免疫反應(yīng),。CD42b免疫組化

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