免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20,，抗體濃度過低,，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,，影響結(jié)果的觀察,。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右）,，高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長染色時間,。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。免疫熒光技術(shù)中,，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。CK14免疫熒光檢查

基于熒光成像的技術(shù)對于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用,。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時,，熒光成像技術(shù)的分析能力增加，增強了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實用性,，使其成為寶貴的工具,。免疫熒光顯微鏡通過使活細(xì)胞成像能夠可視化整個細(xì)胞器,，徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù),。免疫熒光（IF）是一種強大的免疫染色技術(shù),，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體,。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原,；可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài),；并分析免疫反應(yīng),。JNK免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用,。

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞,、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，操作小心,，防止細(xì)胞脫片。對于懸浮細(xì)胞：有2種方法,，①先在懸浮液中進行固定步驟，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上,，干燥后細(xì)胞會緊貼在載玻片上,。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟，離心洗脫,，然后用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)染色步驟,。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后,，可以直接進行固定等后續(xù)操作,。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進行脫蠟和抗原修復(fù)處理,。

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小,，因此夾取的時候要小心,，注意 反正面，放在皿里洗比較方便,，避免了來回夾取,，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來,。洗的時候我都是多加PBS,，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,，PBS洗三遍,。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍,。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜,，也可37度2小時,，感覺前者效果好，PBS洗三遍,。6. 二抗室溫2小時(避光),，或者37度1半小時，PBS洗三遍,。7. 較好用DAPI染核,，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS,，甘油封片,，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干,，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂,。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實現(xiàn)精確的免疫檢測,。

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）,；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位,，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置,。JNK免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。CK14免疫熒光檢查

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能,、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài),，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時,，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光,；而一旦停止供能,，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多,，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光,，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光,。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標(biāo)記。CK14免疫熒光檢查

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