細(xì)胞免疫熒光實驗常見問題:1,、信號弱或者無信號：細(xì)胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育,。2、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過高,；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分,；樣本變干,，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì),。occludin免疫熒光染色

細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7,、4 37度 PBS 2小時,。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3,。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘,。7. 一抗,，4度過夜，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時,。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時,。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時,。CD4免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實現(xiàn)可視化檢測,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑,。在進(jìn)行免疫熒光檢測時,，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時,，熒光團與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后,，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后,，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法,。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點是方法簡便,、特異性高，非特異性熒光染色少,。缺點是敏感性偏低,；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢,、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),。alpha 1 Fetoprotein免疫檢測

使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟,。occludin免疫熒光染色

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中,，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后,，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中,。occludin免疫熒光染色

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