熒光的產(chǎn)生：一此化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài),，當其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時,，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光,；而一旦停止供能,，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多,，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應(yīng)所引起的稱為化學熒光,，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光,。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標記。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病,。P62免疫檢測

細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃，室溫避光孵育1小時,。注意二抗帶有熒光素標記,，因此操作過程盡量在暗處進行。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細胞核，一般為藍色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源,。VWF免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞凋亡和細胞存活。

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透,。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達到效果,；從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時間,，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周,。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等,。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合,，用于檢測或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體,，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù),。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術(shù)。免疫熒光技術(shù)在生物學研究,、醫(yī)學診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進行細胞免疫熒光過程中,，需要用到細胞爬片,，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在爬片上生長,，進而進行細胞的免疫熒光,。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大,；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術(shù),。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病,。CD14免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。P62免疫檢測

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine,，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光,。P62免疫檢測

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