細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔,，防止將細胞爬片夾碎,，影響實驗進程,。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅,?；蛘叻庞诎岛袃?nèi),，暫時保存于4度冰箱,，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時,，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標記物質(zhì)進行免疫熒光實驗。CD80免疫熒光試驗

熒光標記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結合一抗的檢測相比,，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體,，因此物種交叉反應性問題增加,；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數(shù)量進行信號放大,；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度,；熒光標記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結合一抗的檢測相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體,，因此物種交叉反應性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時間更長（操作步驟更多）,。GFAP免疫免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合，從而實現(xiàn)可視化檢測,。

細胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶,；孵育過程中干片；抗原熱修復過度,。染色過深：一抗?jié)舛冗^高,；染色試濃度過高或孵育時間過長；染色劑濃度過高或孵育時間過長,。通常實驗室先固定細胞再進行通透,，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定,，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號,；建議設陰性對照組，消除由于抗體非特異性結合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時,，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞,，可安全用于生物制劑,。在進行免疫熒光檢測時，首先對細胞或組織進行固定和透化處理,。進行免疫染色時,，熒光團與目標抗原的抗體結合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號,。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。早期的免疫熒光技術是將抗體與示蹤物質(zhì)結合,，用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。

免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設置下述對照,，以排除某些非特異性熒光染色的干擾,。①標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS,。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體,，再加熒光標記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體,。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色,。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本較好在當天觀察,，隨著時間的延長,，熒光強度會逐漸下降,。熒光抗體技術可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體,。CD80免疫熒光試驗

免疫熒光技術可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治,。CD80免疫熒光試驗

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率,，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外,，也與激發(fā)光的波長有關,。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也較大,。CD80免疫熒光試驗

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