細(xì)胞免疫熒光步驟對大家來說一定是很陌生的,，他是一種抗原抗體反應(yīng),，好像對我們來說他顯得很遙遠(yuǎn)的樣子，因?yàn)槲覀儾⒉涣私馑茏鍪裁?，通過這種技術(shù)可以讓我們對抗原或抗體的性質(zhì),、定位一次來分析出更多的數(shù)據(jù)。細(xì)胞免疫熒光,，這對很多人來說都是一次聽說這個東西,，也不知道他對我們會有什么好處與壞處，科學(xué)研究就是這樣子的,，普通老百姓是不會明白其中的道理的,，但是這些研究也是確實(shí)的在我們的生活中取得了成果，能夠讓大家過的更加舒適,。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì),。X Hu Nuclei免疫熒光IF

免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,，利用定量技術(shù)測定含量，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析,。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測蛋白的細(xì)胞定位,。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞；試劑：4% 組織固定液,，PBS,，Triton X-100，BSA,，熒光二抗,，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液,，0.25% 胰酶,；器材：6/12/24 孔板，細(xì)胞爬片（蓋玻片）,，載玻片,，15 ml 離心管。CD34免疫檢測免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位,。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中,，需要用到細(xì)胞爬片,，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在爬片上生長,，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光,。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大,；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。

細(xì)胞免疫熒光簡單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7、4 37度 PBS 2小時,。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。

熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評估,。IBA-1免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。X Hu Nuclei免疫熒光IF

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅,，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,，以消除不需用的熒光,。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán),、堿性復(fù)紅,。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染,，以減弱非特異性熒光本質(zhì),，使特異熒光更突出顯示。X Hu Nuclei免疫熒光IF