細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高,；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定,，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào),；建議設(shè)陰性對(duì)照組,，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度,，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高,。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法,。TLR4免疫組化

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液,，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時(shí)添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中,。TLR4免疫組化免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景,。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測(cè)定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì),、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原,、多肽,、核酸、受體,、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測(cè),、免疫學(xué)、血型鑒定等,。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次,。封閉：使用封閉液對(duì)樣本進(jìn)行封閉，一般1h,。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過(guò)夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。加二抗：使用間接法時(shí)需要加二抗處理，根據(jù)說(shuō)明書使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片,。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察,。

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）,；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位,，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程,。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個(gè)定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)提供一個(gè)明確的指導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng)、特異性高,、速度快的特點(diǎn),，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù)，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來(lái)顯示目的蛋白,，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活,。TLR4免疫組化

免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。TLR4免疫組化

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí),，動(dòng)作應(yīng)輕柔,，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過(guò)程中,，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密,。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光,。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅,?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱,，盡快拍照,。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。TLR4免疫組化