免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,，經(jīng)過一定時間反應(yīng),，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合,，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng),，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。PDL-1/CD274免疫熒光染色

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴散），固定液包括：有機溶劑（甲醇,、乙醇等）,；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林）,，固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,，不過，目前甲醛用的還是較多的,，但針對磷酸化的抗體,，不適合用甲醛，會導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,，同時應(yīng)注意甲醛會揮發(fā)，在4-8°C不宜儲存太久,。固定時間：取決于組合塊的大小和類型,，對于大多數(shù)組織，18-24h較為理想,，細胞固定時間較短,，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min,，PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。CD45免疫熒光試驗免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時,，從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光,。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋,。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會產(chǎn)生背景熒光,，對結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號,。2、陽性對照：用確認(rèn)含有待測抗原的組織或細胞,，與待測標(biāo)本進行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性,，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3,、陰性對照：與陽性對照相反,，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關(guān)系,。

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡,。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。ucp2免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞凋亡和細胞存活,。PDL-1/CD274免疫熒光染色

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打,，使之成單細胞懸液,，計數(shù)。2)取細胞培養(yǎng)12孔板,，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上,，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細胞生長速度快慢,，觀察判斷細胞密度,，約90%時進行細胞免疫熒光。PDL-1/CD274免疫熒光染色