免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)）,，0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）,；除了TritonX-100,，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透,。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進(jìn)行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min,，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清,、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕,，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。醛類固定的樣品,，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置,。GFAP免疫熒光分析

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20,，抗體濃度過低,，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察,。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。S100A4免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位,。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對單層生長細(xì)胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細(xì)胞爬片時,，動作應(yīng)輕柔,，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實驗進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過程中,，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長過密,。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi),，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照,。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時,，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。免疫熒光技術(shù)中，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù),。

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,，標(biāo)記目的靶點,。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常,。r-H2AX免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全,。GFAP免疫熒光分析

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時,，從孵箱中取出,。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光,。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋,。GFAP免疫熒光分析