通過不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo),，可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白,。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料,、免疫標(biāo)記,、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白,，讓您在成像時更輕松地進(jìn)行觀察,。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上,，從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合,。通過化學(xué)修飾，單個熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式,，且每種變體都有不同的特異性,。免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以檢測非常低濃度的目標(biāo)分子,。CD31免疫熒光

細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項：1,、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果,；2、若實驗室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片,。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強,，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜,，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。CD3免疫免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)和信號通路,。

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外,，也與激發(fā)光的波長有關(guān),。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也較大,。

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h，時間過長,，會使熒光減弱,。2）每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中,，始終保持濕潤,，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑,。在進(jìn)行免疫熒光檢測時，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時,，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號,。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴(kuò)增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇。CD31免疫熒光

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期,。CD31免疫熒光

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小,，因此夾取的時候要小心,，注意 反正面,，放在皿里洗比較方便,，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖,，不要細(xì)胞沖下來,。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉,，沒有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍,。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時,，感覺前者效果好,，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光),，或者37度1半小時,，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片,，指甲油封片子的四周,，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂,。CD31免疫熒光