細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打,，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板,，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上,，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后,，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。P62免疫熒光檢查

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散）,，固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇,、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA,、10%中性福爾馬林）,，固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過,，目前甲醛用的還是較多的,，但針對(duì)磷酸化的抗體,，不適合用甲醛，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā)，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久,。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型,，對(duì)于大多數(shù)組織，18-24h較為理想,，細(xì)胞固定時(shí)間較短,，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min,，PBS浸洗玻片3次,，每次3min。IL-6免疫熒光IF免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答,。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí),，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎,，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過密。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅,。或者放于暗盒內(nèi),，暫時(shí)保存于4度冰箱,，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃，室溫避光孵育1小時(shí),。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,，一般為藍(lán)色熒光；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,，每次 5 min，洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源,。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù),。P-AKT免疫檢測(cè)

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。P62免疫熒光檢查

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí),，從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜,。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。12.95%甘油封片。注：4%甲醛,，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋。P62免疫熒光檢查