熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài),，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射,。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光,。因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸,。在熒光抗體技術中常用一些非熒的色素物質如亞甲藍、堿性復紅,。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀,、碘溶液等對標本進行得當復染，以減弱非特異性熒光本質,，使特異熒光更突出顯示,。熒光抗體技術可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體,。TNFa免疫熒光檢查

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時,，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎,，影響實驗進程,。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅,?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時保存于4度冰箱,，盡快拍照,。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。TNFa免疫熒光檢查免疫熒光技術具有高靈敏度和高特異性,，可以檢測非常低濃度的目標分子,。

其他熒光物質：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質,。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）,、鋱（Tb3）,、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應用較廣,。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定,。

免疫熒光的原理：免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性,，所以當抗原抗體發(fā)生反應時,，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上,，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應,。直接法:將標記的特異性熒光抗體,，直接加在抗原標本上,，經(jīng)一定的溫度和時間的染色,，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片,、鏡檢,。免疫熒光技術可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常,。

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復用能力（可以結合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質）,；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素,，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞,，從而確定抗原或抗體的性質,、定位，以及利用定量技術測定含量,。免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合,，從而實現(xiàn)可視化檢測。Desmin免疫抗體

熒光抗體技術可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質,。TNFa免疫熒光檢查

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,，TRITC）結構式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色,。其異硫氰基可與蛋白質結合,，但熒光效率較低。免疫熒光技術又稱熒光抗體技術,，是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術,。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合,，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質的定位。TNFa免疫熒光檢查