免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍,，可以測定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì),、細胞因子,、細胞表面抗原、多肽,、核酸,、受體,、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標志物,、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測、免疫學,、血型鑒定等,。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次,。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉，一般1h,。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理,，根據(jù)說明書使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片,。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞信號傳導和信號通路,。collagen3免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學,、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)是標記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功,。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應用,，所以人們習慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)COL-1免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍,，可以測定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì)、多肽,、核酸,、神經(jīng)遞質(zhì)、受體,、細胞因子,、細胞表面抗原、肉瘤標志物,、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病,、內(nèi)分泌,、藥物檢測、免疫學,、血型鑒定等,。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490495nm，較大發(fā)射光波長520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,。

免疫熒光-實驗步驟：細胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔,；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜,。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇,。

細胞和組織樣品處理：準備熒光標記的細胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應建立針對目的蛋白和細胞結(jié)構(gòu)的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細胞樣品用于標記–首先將細胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內(nèi)部,，標記目的靶點,。封閉細胞樣品，防止熒光標記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,。collagen3免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學研究中具有普遍的應用前景,。collagen3免疫組化IHC

免疫熒光間接法測抗體實驗步驟：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片,，10min后棄去,，使標本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本,，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。取出玻片,，置于玻片架上，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min,，不時振蕩。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體,。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min。重復操作3,。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油,，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法,。collagen3免疫組化IHC