細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí),，動(dòng)作應(yīng)輕柔,，防止將細(xì)胞爬片夾碎,，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過程中,，要注意將細(xì)胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長過密,。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi),，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照,。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。col-10(COL-X)免疫抗體

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng),、敏感性高、速度快,。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染,，并且大多操作簡便，便于推廣,。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn),。由于一般熒光測定中的本底較高等問題,，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定,，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。col-10(COL-X)免疫抗體免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。

免疫熒光檢測相對(duì)于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測定相反）,；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,，以及利用定量技術(shù)測定含量,。

免疫熒光間接法測抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。取出玻片，置于玻片架上,，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min，不時(shí)振蕩,。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥,，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體,。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。重復(fù)操作3,。取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油,，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,，結(jié)果判定同直接法,。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能,、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài),，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光,；而一旦停止供能,，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多,，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光,，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究,、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。Fibronectin免疫抗體

免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估,。col-10(COL-X)免疫抗體

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時(shí)間長，較適合用于分辨熒光免疫測定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡,。col-10(COL-X)免疫抗體